人类外周血染色体制备

人的外周血淋巴细胞培养疗法是1960年由Moorhead提出来的。正常情况下，人外周血小淋巴细胞都处在G1期(或G0期)。但在体外给予一-定的条件，进行培养，经72h就可获得大量的有丝分裂细胞。这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。

在培养液中加入植物血凝素(PHA)，淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂短期培养后，经秋水仙素处理，可抑制细胞分裂时纺锤丝的形成，使细胞分裂停止在中期．同时它可改变细胞质的黏度，引起染色体在细胞质中分散。经低渗和固定，即可得到大量的、分散效果好的染色体分裂象。人体的1mL外周血中一般含有约(1～3)×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。

一、试剂配制

1. 培养基的配制：

RPMI 1640培养基        4ml

小牛血清                     1ml

青霉素和链霉素    各100U/ml

PHA                          0.2ml

肝素                         1小滴

以5％ NaHCO3调pH至7.2～7.4。4℃备用。

2. 肝素：称取0.2g溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2％，灭菌。

3. 秋水仙素：生理盐水配制成20μg/ml浓度，灭菌，分装，置-20℃。

4. 低渗液：0.075 mol/L KCI

5. 固定液：甲醇:冰乙酸(3：1)，临时配制。

6. Giemsa工作液：1份原液和9份磷酸缓冲液，临时配制。

7. 磷酸缓冲液：1/15mol/L Na2HP4、1/15 mol/L KH2PO4等体积混合。

8. 5％NaHCO3火菌滤器抽滤备用。

二、实验步骤

1. 接种，培养

（1）在无菌条件下，用灭菌注射器吸取0.2％肝素液(用生理盐水配制，灭菌)0.2ml，湿润针筒后，采静脉血1～2ml、转动注射器使血液与肝素充分混匀。

（2）无菌条件下，将肝素化血液滴入至外周血培养基内，每5ml培养液内滴入血滴28～30滴（7号针头）轻轻混匀。

（3）置37℃恒温箱内，静止培养68～72h。注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象，可每天将培养液摇一摇以便细胞得到充分培养。

（4）终止培养前2~3h，加入浓度为20μg/ml的秋水仙素，每5ml培养基中用7号针头，加3~4滴使最终浓度为0.1μg/ml。轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养2~3h，以积累较多停止在中期的分裂象。

2. 制片

（1）收获细胞：由恒温箱取出培养瓶，用吸管充分吹打培养瓶瓶壁，使细胞全部脱离瓶壁，然后将细胞液移至锥形离心管内，1500转/min，离心10min，去上清液。

（2）低渗处理：加入37℃预温的0.075mol/L KCl 8ml，反复吹打(约一百次)后，置37℃水浴箱中低渗处理25min左右。

（3）预固定：加入新鲜制备固定液1ml（甲醇:冰醋酸=3:1），轻轻混匀。

（4）离心：2000转/min，离心10min，吸弃上清液。

（5）固定：沿离心管壁慢慢加入固定液8ml，轻轻混匀，制成细胞悬液。

（6）离心：同上，吸去上清液。

（7）再固定：加固定液8ml，混匀，固定10mn。

（8）离心：同上，吸去上清液。。

（9）制细胞悬液：根据细胞量多少，加入适量固定液，充分混匀，制成细胞悬液。

（10）滴片：取出预先经冰水浸泡的载玻片，用吸管吸取混匀的细胞悬液在离冰片约30cm距离进行滴片，每片约滴2～3滴细胞悬液，使细胞较好分散。一般每一培养瓶可制3～5张标本片。

（11）染色：标本晾下后，即可用染液（Giemsa液原液1份，pH6.8的磷酸缓冲液9份）染色15min，自来水冲洗后（从背面冲洗）晾干。

3. 镜检：人类每个体细胞有46条染色体，根据染色体的长度和着丝粒位置的不同，可以分成22对常染色体和一对性染色体，男子是是46，XY；女子是46，XX。

1. 秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长，故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。

2. 固定液应在使用前临时配制。

3. 载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。

4. 染色体分裂指数低：患者处于非常时期(放、化疗期)；培养基营养成分不良；培养基pH偏低或偏离；PHA过量或不足；小牛血清质量不高；培养箱温度偏低；秋水仙素处理时间过短。

5. 接种的血样愈新鲜愈好。

6. 培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。