人外周血染色体制备

1. 实验原理　人的外周血淋巴细胞培养方法是1960年由Moorhead 提出来的。正常情况下，人外周血小淋巴细胞都处在G1期（或G0期），但在体外给予一定的条件，进行培养，经72 h就可获得大量的有丝分裂细胞。这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。
在培养液中加入植物血凝素（PHA），淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，可抑制细胞分裂时纺锤丝的形成，使细胞分裂停止在中期，同时它可改变细胞质的黏度，引起染色体在细胞质中分散。经低渗和固定，即可得到大量的、分散效果好的染色体分裂象。人体的1ml外周血中一般含有约（1～3）×10 ⁶ 个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。本节介绍人外周血淋巴细胞的悬浮培养法，以及染色体标本的制备。
2.  试剂 与器材
（1）2ml注射器、培养瓶、刻度吸管，需15磅灭菌20min。离心管、吸管、量筒、载玻片，经洗液按常规清洗、烘干备用。
（2）超净工作台，恒温培养箱，天平，离心机、显微镜等。
（3） 试剂 ：
① 培养基的配制：
RPMI 1640培养基     4ml
小牛血清            1ml
青霉素和链霉素      各100IU/ml
PHA                 0.2ml
肝素                1小滴
以5% NaHCO3调pH至7.2～7.4, 4℃备用。
② 肝素：称取0.2g溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2%，灭菌。
③ 秋水仙素：生理盐水配制成20μg/ml浓度，灭菌，分装，置－20℃。
④ 低渗液：0.075mol/L KCl。
⑤ 固定液： 甲醇∶冰乙酸（3∶1），临时配制。
⑥ Giemsa工作液：1份原液和９份磷酸缓冲液，临时配制。
⑦ 磷酸缓冲液：1/15mol/L Na2HPO4、1/15mol/L KH2PO4等体积混合。
⑧ 5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。
3. 实验步骤
（1）接种，培养。
① 在无菌条件下，用灭菌注射器吸取0.2%肝素液（生理盐水配制，灭菌）0.2ml，湿润针筒后，采静脉血1～2ml、转动注射器使血液与肝素充分混匀。
② 无菌条件下，将肝素化血液滴入至外周血培养基内，每5ml培养液内滴入血滴28～30滴（7号针头）轻轻混匀。
③ 置37℃恒温箱内，静止培养68～72h。注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象，可每天将培养液摇一摇以便细胞得到充分培养。
④ 终止培养前2～3h，加入浓度为20μg/ml的秋水仙素，每5ml培养基中用7号针头，加3～4滴使最终浓度为0.1μg/ml。轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养2～3h，以积累较多停止在中期的分裂象。
（2）制片。
① 收获细胞：由恒温箱取出培养瓶，用吸管充分吹打培养瓶瓶壁，使细胞全部脱离瓶壁，然后将细胞液移至锥形 离心管 内，1500转/min，离心10min，去上清液。
② 低渗处理：加入37℃预温的0.075mol/L KCl 8ml，反复吹打（约一百次）后，置37℃水浴箱中低渗处理25min左右。
③ 预固定：加入新鲜制备固定液1ml（甲醇∶冰醋酸=3∶1），轻轻混匀。
④ 离心：2000转/min，离心10min，吸弃上清液。
⑤ 固定：沿 离心管 壁慢慢加入固定液8ml，轻轻混匀，固定10min。
⑥ 离心：同上，吸去上清液。
⑦ 再固定：加固定液8ml，混匀，固定10min。
⑧ 离心：同上，吸去上清液。
⑨ 制细胞悬液：根据细胞量多少，加入适量固定液，充分混匀，制成细胞悬液。
⑩ 滴片：取出预先经冰水浸泡的载玻片，用吸管吸取混匀的细胞悬液在离冰片约30cm距离进行滴片，每片约滴2～3滴细胞悬液，使细胞较好分散。一般每一培养瓶可制3～5张标本片。
{11} 染色：标本晾干后，即可用染液（Giemsa液原液1份，pH6.8的磷酸缓冲液9份）染色15min，自来水冲洗后（从背面冲洗）晾干。
（3）镜检：人类每个体细胞有46条染色体，根据染色体的长度和着丝粒位置的不同，可以分成22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。