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人类外周血染色体制备

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一、原理

人外周血小淋巴细胞,通常都处在G1期(或G0期),一般情况下不进行分裂。如在培养液中加入植物血凝素(PHA),这种小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞,进入有丝分裂。短期培养后,经秋水仙素处理,低渗和固定,即可得到大量的有丝分裂细胞。人体的1ml外周血内一般含有约1×106~3×106个小淋巴细胞,足够染色体标本制备和分析之用。

二、用品和试剂

1. 5ml注射器(7号针尖),培养瓶、刻度吸管,需15磅灭菌20分钟。离心管、吸管、量筒、载玻片,经洗液按常规清洗、烘干备用。

2. 超净工作台,恒温培养箱,天平,离心机、显微镜等。

3. 试剂:

(1)RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液,并加入NaHCO3 2.0克/1000ml以缓冲pH。完全溶解后经0.22 μm灭菌滤膜抽滤除菌。

(2)肝素钠(肝素):称取0.2g溶于100ml双蒸水中,浓度为0.2%,15磅20分钟灭菌。

(3)秋水仙碱(秋水仙素〕,生理盐水配制成10μg/ml浓度,15磅20分钟灭菌,分装,置-20℃。

(4)低渗液:0.35%KCl。

(5)固定液(Carnoy固定液) 甲醇∶冰乙酸(3∶l),临时配制。

(6)Giemsa工作液:1份原液和10份磷酸缓冲液,临时配制。

(7)磷酸缓冲液:1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等体积混和。

(8)5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。

三、操作步骤

(一)细胞培养

1. 培养基的配制:

在超净工作台中,100ml培养基含以下成分和比例:

RPMI-1640 84ml

小牛血清 15ml

PHA 3支

肝素钠 1ml

卡那霉素 终浓度为100单位/ml

以5% NaHCO3(无菌)或1N HCl调pH至7.2-7.4.

用刻度吸管将培养液分装入培养瓶(10ml/瓶),4℃备用。

2. 采血:酒精消毒皮肤,肘静脉采血0.3-0.5ml,立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞,向10ml培养基中注入30-40滴全血,轻摇匀后置37℃恒温箱培养。

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