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    用母体血进行染色体异常的产前诊断实验

    相关实验：用母体血进行染色体异常的产前诊断实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    Ficoll 淋巴细胞分离液 CD3、CD13 抗体均用生物素标记
    PBS 溶液 台盼蓝溶液 . 量化链霉亲和素 磁化稀土 FBS溶液 FITC 标记的 CD71 膜抗体 多聚甲醛 carnoy 固定液 乙醇溶液
    氩离子激光 流式细胞仪 直标探针

    步骤

    3.1 血细胞分离 1 . 抽 取 约 30m L 静脉血置于肝素钠抗凝采血管中（见 注 解 2)。 2 . 吸 取 15m L 血样加到50m L 聚酯锥形管中，并 加 15mLPBSE (血 和 PBS E 的终体积比为1 : 1)。 30m L 血样分到2 个 50m L 聚酯锥形管中。 3 . 用消毒的注射器和巴氏吸管将1〇 〜15m L 淋巴细胞分离液加于上述混合 液管底，抒紧管盖， 1600r/min (200g ) 离 心 25min。 4 . 小心地将管取出，用 真 空 泵 和 巴 氏 吸 管 吸 掉 上 层 （主要成分为血浆和血 小板）弃去，留下此层约1cm。 5 . 用 IOmL移液管吸取上面两管的单核细胞层，混 合 于 50m L 管内， 1600 r/m in (200g〇 离心 lOmin。 6 . 倒掉上清，用 50m L 的 PBSE重 悬 细 胞 沉 淀 ， 1200r/min (IOOg) 离心 5min。倒掉上清，用与最初血样等体积的PBSE (30mL，见 注 解 3 ) 重悬细胞沉 淀 ，涡旋振荡器上振荡以获得均一的细胞悬液。 7 . 取 5(^L 细胞悬液分装到5m L 聚酯管中，每 管 加 50juL的 0. 2 % 台盼蓝 后 ，将细胞置于血球计数板上计数，用 PBSE/ 2 % FBS悬浮 细 胞 至 终 浓 度 20X
    3 . 2 定量磁力微粒去除 1 . 将 CD3-生 物 素 和 ⑶ 13-生物素按IO6 个 细 胞 中 加 I iUg的浓度混合进行细 胞染色。置冰上孵育20min。 2 . 用 PBSE洗 细 胞 悬 液 2 次 ，在 15m L 聚 酯 管 中 用 PBSE/ 5 % FBS重悬细 胞 ，使细胞终浓度为IOXlO6 个/mL。 3 . 加适量洗过的抗生物素磁力微粒（量的计算见本章2. 1.2)，置冰上孵育 15〜20min，每 隔 5m in进行旋转确保微粒和细胞的悬液均一。 4 . 将 管 置 于 磁 场 中 5min，用电动吸管小心移去未结合的细胞，置于新的 15m L 聚酯管内。再次进行磁场分离以确保去除所有磁性微粒，将未结合的细胞 转移到第三个干净的15m L 聚酯管内。 5 . 离心未结合的细胞，用 10〜20m L 的 PBSE重悬，如 上 述 3 . 1 中第7 步的 方法计数去除后细胞。用 PBSE/2% FBS液重悬细胞，使细胞 终 浓 度 为 20X 106 个/mL〇 IO6 个 /m L 0 3 . 3 细胞表面染色 1 . 在 每 IX lO 6 细 胞 中 加 1啤 的 CD71-FITC (为厂家推荐量一半）和 IOjtxL 的 CD45-P E 稀 释 液 （见 本 章 2. 1. 3)，置冰上孵育20min。 2 . 用 PBSE/2%FBS液洗细胞后，用 3 % 多聚甲醛重悬细胞至终浓度为IOX IO6 个/mL，置冰上孵育60 min。 3 . 用 PBSE/ 2 % FBS液洗细胞2 次 ，然 后 用 PBSE/ 2 % FBS液重悬细胞至终 浓度 IOXlO6 个/mL。 4. 4°C避光保存，以备分选。 3 . 4 流式细胞分选 1 . 调整氩激光到波长488nm， 在 50m W 水平操作。 2 . 颜 色 补 偿 ： 2 5 % 〜3 0 % FTTC信 号 源 于 P E 信 号 ， 5 % P E 信号来源于 FITC 信 号 ，通过相应的单色或双色荧光染料染色的样品调试得到。 3 . 液滴振动频率提升到30k H z 以生成更多更小的液滴，鞘 液 压 力 为 12psi (lpsi=6. 894 76XIO3Pa)0 4 . 采用双液滴偏离和非同步性进行分选。根据分离和去除后的细胞浓度， 用 0. 2〜2mL PBS/ 2 % FBS悬浮样本，使得流动速度为1000〜6000个/s。
    5 . 前向角光散射作为直线信号被收集，所有的发射荧光用四级十进对数标 尺进行收集。设置光散射门以消除碎片和聚集。靶细胞为CD45-和 CD71+。 3 . 5 细胞收集 将一个甲硅烷基化的载玻片置于分选细胞束通路上，以收集需要的细胞。然 后使载玻片在空气中完全晾干。干燥的载玻片标本于新鲜的C am oy固定液中固 定 2 次 ，每 次 15 min，使细胞黏附在载玻片上的同时可以去除残留的流式分选 Isoton I I 液 。玻片晾干后一20°C保存以备FISH 操作。同 样 ，也可用一无菌的小 离心管代替载玻片收集悬液中的细胞。用 PBSE/2%FBS液洗脱分选的细胞^ 以 去除残留的盐，然 后 制 成 20〜50p L 的细胞悬液， 4°C保 存 以 备 F IS H 操作使用 (见 注 解 4)。 3. 6 五色 FISH 1 . 将标本于室温的2X SSC 中放置5min。 2 . 将 标 本 在 7 0 % 、 9 0 % 、 1 0 0 % 的 系 列 乙 醇 中 各 2m in使 细 胞 D N A 脱 水 ， 空气中完全晾干。 3 . 将标本置于7 0 % 甲酰胺/2X SSC 中 20m in 以变性细胞DNA。该变性时间 的确定基于3 % 多聚甲醛的固定。如果甲醛浓度低于3 % ，变性时间应相应减少 5〜lOmin。还应注意：一次变性的标本多于一张，每增加一张标本，变性液的 温度将被降低T C ，因此应将水浴温度相应提高。 4 . 在 20m in变 性 的 问 时 ，开 始 准 备 五 色 探 针 混 合 液 ，并在冰上避光保存 备用。 5 . 迅速将变性好的标本置于7 0 % 、 9 0 % 和 1 0 0 % 乙 醇 （均为一20°C ) 中脱 水 各 2 min，空气中完全晾干。 6 . 将 5 个探针混合液在70°C水浴中变性5min。 7 . 将 变 性好的探针混合液迅速加于玻片上的目标杂交区，盖 上 22mmX 22m m 盖片，并用橡皮泥封片。 8 . 将标本置于37°C湿盒中杂交过S (16h)。 9 . 次日早晨，将 装 在 有 盖 染 色 缸 中 的 约 40m L 的 2 X SSC在水浴中预热 至 70V 。 10. 每次只处理一张标本，去掉盖片和橡皮泥，然 后 在 70°C 的 2 X S S C 中 洗 l 〇 s 。 11. 立即转入IX P B D 内 lm in。 12•在24m m X 50m m 盖片上加18julDAPI-I I 复染液，用纸巾吸去标本表面
    多余 的PBD后将其倒扣于加D A PI的盖片上。轻压排除气泡，将标本置于避光 玻片盒内，避免过多暴露于光线中。 13.待 D A PI复染细胞IOmiri后即可在荧光显微镜下观察。分析完毕后，标 本置片盒内4°C保存。 3. 7 镜检分析 1 . 通过探针标记的特异颜色识别每条待检的染色体，对每个细胞进行分析 每种探针显示的〇、 1、 2、 3 或更多信号。尽管我们曾随意选择每一杂交反应 3000个核进行分析，事实上经过流式细胞分选后每一样本平均仅能获得约1500 个 核 供 FISH 分 析 （见 注 解 5)。 ， 2 . 男胎细胞可通过一个X 信 号 （黄色）和 一 个 Y 信 号 （蓝色）进行识别 (见 注 解 5)。 3 . 计 数 3 种直接信号可检测胎儿13、 18、 2 1 三体。判断结果时， 3 种信号 计数必须注意区分信号和信号分离的情况。由于间期核不同阶段，染色体的浓缩 程度不同，大 部 分 FISH 探针都是由好几个DNA 片段组成。信号分离可能出现 在一条或是两条同源染色体上。一般认为判断为信号分离的标准有两个：①两个 信号的大小和亮度都小于另一同源染色体的信号；②两信号间的距离比两个信号 的 直 径 小 （见 注 解 6)。 3. 8 MACS 细胞的 FISH 对 用 MACS方法从母亲血中富集的细胞进行F IS H 的操作程序有一些改动 (见 注 解 7)。 4 . 注释 1 . 用多种探针检测非整倍体时，用荧光素检测的抗体可能会影响F IS H 分 析 。用 FITC 标记的抗体染色细胞内含量丰富的蛋白质（如 7-珠蛋白）会导致整 个细胞核都被荧光覆盖。用发射绿色光谱范围的荧光素标记的探针很难识别，限 制了用于F IS H 分析的染色体特异性探针的数量。因此，非常重要的是：在做 FISH 之前应了解FACS富集细胞过程中使用了哪些荧光染料。 2 . 富集前血液标本的保存温度控制对保持良好的标本质量，这对随后的细 胞分离和FISH 都很重要。若隔夜保存，标本可放室温。过高或过低的温度条件 会引起细胞成团或细胞溶解，导致收集细胞失败。在每年夏季的几个月中运送细 胞有必要用冰袋。
    3 . 不管用什么类型试剂、什么浓度分离细胞，尽量将获得的细胞层洗干净 很重要，避免细胞质残留或核聚集成团以影响FISH 分析。 4 . 在细胞质中有似是而非的颗粒，使得细胞核看上去被薄雾状物覆盖。探 针几乎杂交不上。由于传统的细胞遗传分析实验，细胞的洗脱不彻底、没在严格 的温度和湿度条件下进行细胞干燥。为避免这种情况，细胞直接分选到硅化玻片 上 后 ，在 37°C恒 温 板 上 放 30〜60m in 瞭干，然 后 用 Carnoy液固定。用 Carnoy 液固定后，同样要注意温度和湿度问题。当 湿 度 较 低 或 暖 气 房 间 （如冬季） ，同 样可能会出现细胞质颗粒样背景问题。为避免这个问题，可 在 Camoy液固定后， 将玻片水平或垂直放在小盒子里维持湿度，缓 慢 晾 干 。或 者 ， （用 FACS或 MACS) 收集到的细胞滴片前可以先放到塑料管内洗脱。为防止细胞损失，不进 行细胞离心，重悬在小于1〇〇 〜2〇〇juL的体积中再进行滴片。 5 . 胎儿细胞富集方法大约能将收集胎儿细胞的效率提高100倍 ，所以大概 能 在 每 1000个母血细胞中收集到1 个胎儿细胞，而这之前是平均IO5 个母血细 胞中能收集到1 个胎儿细胞。根据采用的细胞分离和富集方法，收集和扫描的细 胞总数都将发生改变。我们的研究小组每个标本可分析到3000个核。如果在分 析 3000个细胞核后仍没发现1 个胎儿细胞，我们发现分析更多的细胞也不太有 发现胎儿细胞的可能。 6 . 在分析的同时，每位观察者应将每个核的判断记录在表格中。如在临床 细胞遗传学分析一样，在玻片上按从左到右、从上到下的方式进行系统的细胞分 析 。熟练的观察者能在2〜3h 内在一张用三种探针杂交的玻片上分析3000个核， 在 用 5 种探针杂交的玻片上记数同样的细胞核数则需3〜5h 。在传统的细胞遗传 学产前诊断中，确诊胎儿非整倍体需要发现多个克隆。但如果是用胎儿细胞分 析 ，只要在收集到的胎儿细胞中发现一个三倍体细胞，结果与胎儿核型结果一致就 能确诊。当然，前提是在杂交效率理想的条件下，所有或大部分细胞核都有信号。 7 . 对 MACS收集到的细胞若不用多聚甲醛固定或用1 % 〜2 % 的低浓度固 定 ， FISH 较容易成功。 MACS收集到的细胞应在相差显微镜下评估。如果细胞 核灰色而扁平，用 80°C烤 炉 （非甲酰胺）变 性 1〜3m in 即可。若用多聚甲醛固 定 ，变性时间应相应延长。如果杂交无信号或信号弱，则需要用蛋白酶K 或胃 蛋白酶进行前处理。

    来源：丁香实验

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