正常兔原代晶状体上皮细胞培养方案

实验材料：

1. 正常兔晶状体组织；

2. 不含Ca ²⁺ 和Mg ²⁺ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. 注射器；

4. 培养器具：培养瓶或皿（ 用多聚赖氨酸包被）、眼科剪、镊子等；

培养方法：

1. 空气注射处死大兔，在无菌条件下清除巩膜外肌肉及结缔组织后将眼球浸入含双抗的1×PBS（pH7. 2 ）浸泡5min ，移入超净工作台内；

2. 用含双抗的1×PBS（pH7. 2 ）冲洗 组织3遍，在超净台中环形剪除角膜放射状剪开并撕除虹膜，充分暴露晶状体赤道部，用眼科镊尽量靠近赤道部撕下晶体前囊膜，将前囊膜剪成1× 1 mm² 大小的碎片 ；

3. 取200μl的吸头一只，在酒精灯上用火焰烧弯。用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20 - 25块左右，每小块间距0.5cm左右 ；

4. 组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倒置在培养箱中，干贴壁2-4h ；

5. 干贴壁完成后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养；48h后换液，更换2-3ml即可 ；

6. 贴块贴壁培养4-7d后，在镜下观察可见大量细胞爬出，用吸管将组织块吹下、去除，继续放置于37℃，5% CO₂ 培养箱中 ；

注意事项 ：

1. 材料预处理时要注意小心，不要破坏晶状体结构，要注意晶状体前后，确保撕取的是前囊膜。

2. 将组织块贴于培养瓶中后，对于培养瓶的移动，翻转，加液等动作一定要轻柔，以免使组织块浮起。

3. 去除组织块的时机要选择好，去除过早，细胞数量太少，会使细胞生长速度变慢，去除时间太晚，会使部分区域细胞生长过密，导致细胞老化，影响细胞状态。

4. 严格控制上皮细胞培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。

5. 关于培养瓶包被与否，有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中，可以酌情考虑是否包被。

6. 传代培养细胞接种量为5×10⁴ 个（25 cm²培养瓶），细胞倍增时间为48小时。细胞传代培养最佳为3-5代，5代后晶体上皮细胞明显成纤维细胞化，呈梭形或条状，细胞大小不等，细胞相互分离形成拉网现象，传代消化时间会有所延长。