兔晶状体上皮细胞培养方法和体会

1、原代培养：

健康成年白家兔空气栓塞处死,立即取出眼球,1∶1000庆大霉素生理盐水冲洗干净,置超净工作台无菌操作。角膜缘剪开去除角膜、虹膜,将晶状体前囊膜连同赤道部囊膜撕下,Hank液冲洗,剪成1mm×1mm小块,上皮面向下置25mL组织培养瓶内贴壁培养。

把培养瓶轻轻翻转,加入适量的加入含15%胎牛血清的DNEM营养液,囊膜片在瓶内的上面而培养液在下面。置于37℃、5%CO2、95%空气、100%湿度的CO2培养箱中孵育4-6h左右,待囊膜片贴壁后再将培养瓶调回原位,此时培养液覆盖囊膜片而不使囊膜片漂浮,每周换液2次。

晶体上皮细胞在接种3天后,在倒置显微镜下可见,植块边缘有新生的细胞爬出,细胞呈规则六边形,大小均匀,胞质透明。一周后可融合成小片细胞。二周后可长满融合成单层细胞。细胞多为类圆形、多角形。

2、传代培养：

细胞铺满瓶底或生长到一定密度时,用0.25%胰蛋白酶消化,1∶2传代培养。传代时在培养瓶或培养皿底放置适当大小的盖玻片,细胞生长其上,便于光镜及免疫组化观察。细胞一般24h内贴壁,约3～4d细胞可达融合,融合的细胞和原代相似,大小基本一致。传代超过4～6代时,细胞的增长显著下降,转变成成纤维细胞形、三角形和长形。

3、个人体会：

晶状体上皮细胞位于晶状体前囊膜及赤道部囊膜下，单层排列，没有其他细胞成分，是绝对的单一细胞培养。但细胞数量少较难贴壁。所以采用先置于培养瓶待其贴壁后翻转浸入培养液。另外要注意将囊膜剪小，上皮面向下，操作时有点难度的。

培养基没什么特别的，用小牛血清也可以，但生长较慢。一般把多个囊膜置于同一培养瓶加大组织密度，效果较好。个人认为最好不用酶消化法，因为本来细胞就很少了。