【原创】Western－blotting：SDS-PAGE和免疫印迹

Western－blotting：SDS-PAGE和免疫印迹
一：蛋白质的提取
1、取出细胞，倒去培养液，用PBS洗涤细胞一次，充分除去PBS液体，把细胞置于冰上。配置细胞裂解液，细胞裂解液用灭菌水配置，然后按照1：100比例加入PMSF混匀，然后按照细胞的多少加入裂解液于培养瓶中，在冰上放置20min。在此期间每隔3-5min摇晃培养瓶，让其充分裂解细胞。
2、裂解结束后，吸取裂解液于另一只1.5ml离心管中，于4℃13000r/min 离心15min。
3、离心结束后，吸取离心管内上清于另一只干净离心管中。于-20℃保存。
4、根据上样量的多少，计算需要处理的样品，在处理样品时按照1：1比例加入2×buffer。于100℃煮5-10min。结束后短暂离心，于4℃备用。
二、主要试剂的配制：
1、30%丙烯酰胺溶液：取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加水至100ml，过滤，棕色瓶内避光4℃保存；
2、1.5M Tris-HCl分离胶缓冲液，pH8.8 (4x)：取18.15g Tris，用1M HCl调pH至8.8，加水至100ml，4℃保存；
3、1.0M Tris-HCl在浓缩胶缓冲液，pH 6.8(8x)：取12g Tris，用1M HCl调pH至6.8，加水至100ml，4℃保存；
4、电极缓冲液：pH8.3( 1x)：取28.8g甘氨酸，6.04g Tris碱，加10ml 10% SDS，加水至1L，室温保存；
5、10% SDS溶液：取10g SDS，加水至100ml，完全溶解后室温保存。
6、10%过硫酸铵溶液(APS):取0.1g过硫酸铵,加水至1ml,每次用前新鲜配制
7、2X样品缓冲液 0.1M TrisCL，PH6.8；0.2M DTT；4%SDS；2%溴酚兰 ；20%甘油
8、电转印液 pH 8.2-8.3： 甘氨酸 14.42g，Tris base 3.02g，dH2O 800ml，甲醇 200ml， 1N HCL调定pH值至8.2-8.3，室温放置 。
9、考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25g，甲醇 45ml ，dH2O 45ml，加入冰乙酸10ml, 过滤后使用。
10、脱色液：1号脱色液：甲醇250ml冰乙酸 50ml 加dH2O定溶至500ml； 2号脱色液：甲醇 100ml，冰乙酸 75ml，加dH2O定容至1000ml
11、抗体稀释液：1%BSA/PBS。
12、封闭液：2.5-5%脱脂奶粉
三、电泳
1、配置12% SDS-PAGE凝胶电泳
2、配电泳槽，配5%浓缩胶：水 5.5ml，30%丙烯酰胺 1.3ml，1M Tris（PH6.8）1.0ml，10%SDS 0.08ml，取其中1ml与10%APS0.1ml及TEMED4ul混合，封电泳槽，其余备用。
3、配12%分离胶：水 6.6ml，30%丙烯酰胺 8.0ml，1.5M Tris（PH8.8）5.0ml，10%SDS 0.2ml，10%APS 0.2ml，TEMED0.008ml混合，灌胶。小心覆盖一层液体(75%乙醇)。
4、胶凝后，弃掉覆盖层液体，在浓缩胶中加 10%APS0.08ml，TEMED4ul混合灌胶，在插梳子时小心避免气泡。
5、开始所加电压为80V，至溴酚蓝进入分离胶，将电压升至120V，溴酚蓝到达分离胶底部约0.5cm ( 4—5h左右)，电泳完毕，关闭电源。取下凝胶，一块用于考马斯亮蓝染色，另一块用于转印。
6、凝胶考马斯亮兰染色
a. 待溴酚兰指示剂到达分离胶下沿约0.5cm时，关掉电源，倾去缓冲液，取下胶块置于染色盒染色。
b. 染色：在染色盒内倒入染色液，37℃染色3─5h(或室温过夜)。
c. 脱色：用脱色液浸泡，最好能够振摇，换2-3次脱色至背景无色。
d. 凝胶成像保存：用凝胶成像系统将脱色后的凝胶扫描成像保存。
3. 免疫转印：
3.1 小心拆开电泳装置，将胶切角以空位，并将之浸入100ml转移buffer平衡15min。
3.2 推荐预先配好电泳buffer并置于4℃以使之充分去除气体。
3.3 切出比胶稍大的PVDF，在与胶对应处切角作记号。
3.4 以100%甲醇湿润膜15sec，然后转入dH2O中浸润2min。
3.5 转入转印buffer中平衡5min以上。
3.6 组装转印三明治，它由多孔垫片、滤纸（一层）、PVDF、胶、滤纸、多孔垫片组成。
3.7 合上转印盒子，插入转印电泳槽，凝胶面对向负极。
3.8加入足量buffer以45V电压4℃转印18-20hr。
3.9 转印结束后，取出膜并使之干燥，以增强蛋白质结合，室温晾干30min。
4.免疫杂交：（均在室温、振摇条件下进行）
4.1晾干后的膜在2.5%脱脂奶粉-PBS(或者用封闭液)中封闭2 hr。
4.2以PBS洗膜2次×5分钟。
4.3稀释一抗于1％BSA／PBS中与膜孵育1小时。
4.4PBS洗膜15分钟一次，以后再洗4次×5分钟。
4.51％BSA／PBS稀释HRF－标记的二抗并与膜孵育1小时。（其他显色方法）
4.6洗膜：同步骤4。
4.7溶液A与B各0.5毫升等体积混合后，振摇条件下与膜共育1分钟。注意：避光条件下操作。
4.8吸除过量的化学发光试剂，将膜包裹于保鲜膜中。
4.9在暗盒中曝光X片30秒，冲洗胶片，根据结果调整最适曝光时间。