免疫组化染色应该注意的问题

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免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易掌握，但要染好免疫组化，其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作中不断摸索和探讨的事，但最基本的应从以下方面加以注意：
（1） 去除内源酶及内源性生物素　
一般我们进行免疫组化标记的都是一些生物体组织，其中自身含有一定量的内源酶和内源性生物素，而免疫组化各种染色大部分是用过氧化物酶来标记抗体的，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，而组织中的内源性酶同样也能催化底物，使其显色，这就影响免疫组化的特异性，所以在标记抗体的过氧化酶进人组织切片之前就应设法将组织内的内源性各种酶灭活，以保证免疫组化染色在特异性情况下进行。
1) 去除内源酶　
常用的去除内源性酶的方法是3%过氧化氢水溶液。但在含有丰富血细胞的标本中，由于其中含有大量的具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢反应，出现气泡现象，易对组织结构和细胞形态产生一些不良影响，但用3%过氧化氢的方法，能够去除大部分内源性酶，即使有些血细胞在显色后也出现棕黄色反应，但由于其形态结构与组织细胞不同，也易鉴别，而且此方法比较通用易操作，但应注意过氧化氢的浓度不能过高，一般为3%一5%，时间不宜过长，最好室温10min。
2) 去除内源性生物素　
在正常组织细胞中也含有生物素，特别是肝、脾、肾、脑，皮肤等组织中，在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合卵白素，形成卵白素一生物素复合物，导致假阳性，所以在采用生物素方法染色前也可以将组织切片进行0.01%卵白素溶液室温处理20min，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。
3) 灭活碱性磷酸酶　
最常用的方法是将左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值为7.6~8.2，能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。
（2） 抑制非特异性背景着色　
非特异性着色最常见的情况是抗体吸附到组织切片中高度荷电的胶原和结缔组织成分上，而出现背景着色，为了防止这种现象，最好用特异性抗体来源的同种动物灭活的非免疫血清在特异性抗体之前进行处理，以封闭荷电点，不让一抗与之结合，但这种方法一般实验室很难实现，一般常见实用的血清是2%~10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室温下作用10~30min即可，但应注意此种结合是不牢固结合，所以最好不要冲洗，倾去余液直接加一抗，对于多克隆抗体来讲，易产生背景着色，在稀释特异性抗体时可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。
（3） 缓冲液　
免疫组化染色标记是对生物体组织抗原进行标记，抗原抗体最适合的pH值为7.2~7.6，最常用的是0.0l mol / LpH7.4磷酸缓冲液(PBS)。简易配法：5000ml蒸馏水中分别加入l g NaH2PO4、15.6gNa2HPO4 、42.5gNaCl。但如果是采用碱性磷酸酶(AP)作为标记物底物的方法时可以用0.02mol/L TBS pH8.2缓冲液比较好。
（4） 抗原修复　
经甲醛固定的部分组织细胞，可使免疫组化标记敏感性明显降低，这是因为甲醛固定过程中形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇。因此，在染色时，有些抗原需先进行修复或暴露。
抗原修复方法可分为化学方法和物理方法。化学方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制浓度与消化时间要适度。常用的物理方法有单纯加热、微波处理和高压加热。在选用这三种加热法时，浸泡切片的缓冲液的离子强度和PH值、加热的温度和时间均影响着抗原修复效果。目前最常用的修复方法有如下凡种：
1）胰蛋白酶(Trpsin)　　
主要用于细胞内抗原的修复。一般使用浓度为0.1%，37℃作用10min。
配法：0.1g胰蛋白酶加入到0.1%pH7.8CaCl2(无水)水溶液中溶解后即可。
2）胃蛋白酶(Pepsin)　　
主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。一般浓度为0.4%，37℃作用30min。

配法：0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl水溶液中。