实验90 离子交换凝胶柱层析

实验90 离子交换凝胶柱层析

原理

　　在植物生理生化的研究中，往往要从一个组分复杂的混合物中，将性质很相近的生物大分子分离，这是研究工作中一个很关键的问题，需要一种具有高度分辨力的技术，才能满足这一要求。离子交换层析就是这样的技术，能够分离只有很小差异的物质（例如仅有一个氨基酸不同的两种蛋白质），是分离生物大分子的一种重要方法。由于差不多所有的生物大分子都是极性分子，都带有电荷。离子交换层析的基本原理即基于溶质分子所带的电荷，能使所带电荷稍有不同的分子分离。

　　进行离子交换层析的过程有两个主要阶段：第一阶段是加样和产生吸附作用过程，未被吸附的物质则从柱床上流失；第二阶段是物质从柱子上洗脱，彼此得到分离。发生分离作用是由于不同物质所带电荷不同，对离子交换剂有着不同的亲和力，亲和力的大小可以通过改变条件而加以调节，如通过改变离子强度和pH。

制备层析柱

　　1．选择离子交换剂

　　离子交换剂的种类很多，根据交换剂的功能基团可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，阳离子交换剂又分强酸型（如乙基磺酸，SE；丙基磺酸，SP），弱酸型（如羧甲基，CM）。用离子交换剂也有强碱型[二乙基—（2—羟丙基）氨基乙基，QAE]，弱碱型（二乙基氨基乙基，DEAE）。由于交换剂的母体（matrix）不同，又有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等类型。没有一种交换剂对所有物质的分离都是适用的，所以工作开始首先要选定交换剂的类型。要选择交换剂首先应根据分离物质的性质，例如要分离纯化酶，酶是一种蛋白质，蛋白质为两性物质，由于外界环境的pH不同，所带的电荷也不同。当pH值低于等电点时，蛋白质带正电荷，能结合在阳离子交换剂上，此时应选用阳离子交换剂；pH高于等电点时，带负电荷，无疑应选用阴离子交换剂。此外，还应考虑蛋白质的变性、酶的失活等，如果该酶在低pH时不稳定，这样就只能在高于等电点的PH条件下，选用阴离子交换剂进行分离，而不能在低于等电点的PH条件下，用阳离子交换剂进行分离。一般情况下分离的起始缓冲液的PH值总是高于或低于等电点1pH单位（此时应高于等电点1pH）。如果要分离的酶的等电点在文献上查不到，则可以通过简单的试验，确定起始缓冲液的pH值，其方法为：

　　(1)取试管数支，每管中加入0.1g葡聚糖凝胶离子交换剂（或其他类型离子交换剂）。

　　(2)各管用0.5mol/L缓冲液10ml使吸胀，然后用缓冲液洗10次，每次10ml，如为阴离子交换剂则所用缓冲液的pH范围为5─9，阳离子交换剂则用pH4─8，pH间距为0.5。

　　(3)用离子强度较低（0.01─0.05mol/L）pH值相同的缓冲液洗各管中的交换剂凝胶5次，每次10ml，使交换剂平衡稳定。

　　(4)在每管中加入一定量的样品（如要纯化的酶液），摇动试管5─15分钟，放置待胶粒下沉。

　　(5)取每管中的上清液进行分析（测定酶活性）。假如出现图40所示结果，在pH6.0─6.5之间酶蛋白被交换剂结合，这种情况下，起始缓冲液的pH应选用6.5，在该pH下被结合的蛋白质更容易从交换剂上释放，如果选用更高的pH，会给以后从交换剂上洗脱带来困难。

　　此外，还应该考虑交换剂的颗粒大小以及它的硬度，这些都会影响洗脱液的流速。交换剂的孔度虽然不会影响交换的机理，但因位于交换剂内部的功能基团，对大分子物质来说就无法利用，这样就会影响交换容量。另外，还应考虑样品的分子量，如分子量小于10⁶ ，可选用SephadexC─25或A—25；分子量在10⁴ ─10⁵ 之间，则可选用SephadexC—50或A—50，或Sepharose（琼脂糖凝胶）、Sephacel（微晶纤维素）；分子量大于10⁵ ，选用Sepharose或Sephacel都是合适的；对于很大的分子，如分子量超过4×10⁴ ，可用SephadexC—25或A—25，因为它们的微珠最小，在胶粒的表面，可取代的功能基团最多，有利于大分子物质在胶粒表面发生离子的交换。

　　2．选择缓冲系统

　　对于一个缓冲系统来说要考虑的是缓冲成分、离子强度及pH值。如果缓冲离子带的电荷与交换剂功能基团的电荷相反，它们将参与离子交换过程，使局部的pH发生变化。所以阴离子交换剂要用阳离子缓冲液（如Tris、吡啶、咪唑、铵、乙二胺、烷基胺、氨基乙醇等缓冲液）；阳离子交换剂则用阴离子缓冲液（如醋酸、柠檬酸、甘氨酸、磷酸以及巴比妥等缓冲液）。缓冲液的离子强度影响结合能力，离子强度低时对交换剂功能基团的竞争结合能力弱，所以蛋白质与交换剂的结合较强，增加离子强度则增加竞争作用，降低了交换剂与蛋白质的结合能力，结果将蛋白质从交换剂上洗脱。洗脱液的离子强度也可以通过试验确定（与上述选择起始缓冲液pH值的试验相似，用选定的起始缓冲液pH，以₂ 梍5×10^-1 1mol/L NaCl进行测定）。当离子强度为0.1，pH处于等电点±0.5时，则该物质开始从离子交换剂上解离。

　　3．装柱、洗脱分离

　　层析柱的质量直接影响分离的效果，质量差的柱子会降低分辨能力，使峰变宽，流速不稳。在装柱过程中应特别注意不能有气泡进入，产生死体积，以避免已分离的组分重新混合。所以吸胀后的交换剂和配好的缓冲液，应该用真空泵抽除空气。交换剂凝胶用起始缓冲液充分吸胀（吸胀1梍2天），如果交换剂凝胶是瑞典Pharmacia Fine Chemicals产品，直接用缓冲液吸胀即可。如果不是盐式剂型则需要事先用酸和碱作预处理，处理时避免剧烈搅动。柱子装好后至少要用2倍柱床体积的缓冲液流过交换剂，使达到平衡和稳定。样品中离子的组成应该与起始缓冲液相同，如果不同，可以通过在起始缓冲液中透析使其达到一致。如果以后用起始缓冲液洗脱，则加在柱上的样品量一般为柱床体积的1梍5%。如果用梯度溶液洗脱，则应使样品的重要组分，在柱子顶端被吸附，这时样品中组分的含量较样品的体积更为重要，大体积的稀样品不必经过浓缩就可以直接加到柱子上。

　　在通常情况下可用常液洗脱（即用起始缓冲液洗脱），这是最简单而方便的洗脱方式，不需要梯度仪，但分离的时间长些，分离效果也较差。目前用得更多的是浓度梯度洗脱，在洗脱过程中改变离子强度。前面已经提到过，增加离子强度则增加与交换剂上功能基团的竞争作用，降低了交换剂与样品组分的结合能力，结果将组分从交换剂上洗脱，浓度梯度洗脱方式可以提高分离的效果，也可缩短分离的时间。提高离子强度通过梯度装置（仪）连续不断地在缓冲液中加入浓度较大的NaCl来实现。用部分收集器将分离后的不同组分，分别收集在试管中，然后测定（如测定蛋白质含量或酶活性等）各试管中存在的各个组分。层析装置如图41所示。

　　4．层析柱的再生

　　经过层析分离后往往会有一些杂质污染交换剂凝胶或柱床的表面，必须处理除去。上样前应将样品离心或过滤，除去样品中的不溶物，以免污染柱床表面。对于已沉积于柱床表面的不溶物，可人工挖去表层交换剂，再适当补充一些新的。蛋白质、脂类等对交换剂的污染，可分别用0.1mol/L NaOH和1mol/L NaCl洗涤，再用蒸馏水洗至中性，然后用缓冲液平衡。洗涤过程一般可在层析柱中进行。暂时不用的交换剂，加缓冲液制成悬液，加入防腐剂，如0.02%叠氮钠、0.001%醋酸苯汞等，在冰箱中可贮藏一年左右。如用过的交换剂数量较大，则可进行干燥后保存。