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实验26 硝酸还原酶活性的测定

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实验26 硝酸还原酶活性的测定

原理

  硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶,与作物吸收和利用氮

 

  

  简单易行,在一般条件下都能做到。

红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度,但降低偶联作用的速度,颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度,但降低重氮盐的稳定度,所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏,能测定每ml含0.5μg的NaNO2

仪器药品

  721型分光光度计    真空泵(或注射器)

  保温箱         天平

  真空干燥器       钻孔器

  三角烧瓶        移液管

  烧杯

  0.1mol/L磷酸缓冲液,pH7.5(见附表2)。

  0.2mol/L KNO3 :溶解20.22g KNO3 于1000ml蒸馏水中。

  磺胺试剂:1g磺胺加25ml浓盐酸,用蒸馏水稀释至100ml。

  α—萘胺试剂:0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中,稀释至100ml。

  NaNO2 标准溶液:1g NaNO2 用蒸馏水溶解成1000ml。然后吸取5ml,再加蒸馏水稀释成1000ml,此溶液每ml含有NaNO2 5μg,用时稀释之。

操作步骤

  1. .将新鲜取回的叶片(蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可)水洗,用吸水纸吸干,然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片,用蒸馏水洗涤2梍3次,吸干水分,然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份,每份约0.3─0.4g(或每份取50个圆片),分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中:(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 蒸馏水5ml;(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中,接上真空泵抽气,放气后,圆片即沉于溶液中(如果没有真空泵,也可以用20ml注射器代替,将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中,用手指堵住注射器出口小孔,然后用力拉注射器使真空,如此抽气放气反复进行多次,即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中)。将三角烧瓶置于30℃温箱中,使不见光,保温作用30分钟,然后分别吸  注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用,以积累碳水化合物,如果组织中的碳水化合物含量低,会使得酶的活性降低,此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1,6—二磷酸果糖,能显著增加

  保温30分钟结束时,吸取反应溶液1ml于一试管中,加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml,混合摇匀,静置30分钟,用比色计进行比色测

  3. .绘制标准曲线

与重氮化作用及偶联作用的速度有关,温度、酸浓度等都影响显色速度,同时也影响灵敏度,但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行,则显色速度相同,彼此可以比较。

  吸取不同浓度的NaNO2 溶液(例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml)1ml于试管中,加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml,混合摇匀,静置30分钟(或于一定温度的水俗中保温30分钟),立即于分光光度计中进行测定,测定时的波长为520nm,比色,读取吸光度或透光率。然后,以吸光度为纵坐标,NaNO2 浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。

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