硝酸还原酶活性测定对照(空白)制作的具体步骤，需要加哪些东西？

硝酸还原酶活力的测定

1、试剂：

（1）亚硝态氮标准溶液

称取1 g分析纯NaNO2溶于无离子水并定容至1000mL，然后再吸取1mL定容至1000mL,即为1μg/mL亚硝态氮的标准液。

（2）0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液

称取30.0905 g Na2HPO4·12H2O与2.4965 g NaH2PO4·2H2O，加无离子水溶解后定容至1000mL。

以下是硝酸还原酶活性测定对照（空白）制作的具体步骤：

1. 准备试剂：准备好所有需要的试剂和溶液。通常，这些试剂包括：

- 提取缓冲液（如50 mM磷酸缓冲液，pH 7.8）

- 硝酸盐（如NaNO3）

- 光还原剂（如亚硝酸钠，NaN3）

- 增强剂（如有必要）

- 沸水浴

2. 准备对照样本：

- 取一份与待测样本等量的提取缓冲液，作为对照样本的提取缓冲液。

- 在对照样本的提取缓冲液中加入与待测样本相同体积的硝酸盐溶液。

- 如有必要，加入与待测样本相同体积的增强剂溶液。

3. 混合和对照处理：

- 将对照样本的提取缓冲液、硝酸盐溶液和增强剂溶液（如使用）充分混合。

- 将对照样本与待测样本同时进行相同的处理步骤，如提取、离心、加入光还原剂等。

4. 空白对照测试：

- 在进行NR活性测定时，将与照样本的试管与待测样本的试管一起进行光还原反应。

- 反应完成后，测量对照样本中的亚硝酸盐生成量。这将作为NR活性测定的阴性对照，以消除非特异性结果的干扰。

5. 数据分析：

- 将待测样本的亚硝酸盐生成量减去对照样本的亚硝酸盐生成量，得到NR活性的净生成量。

- 根据实验条件和试剂浓度，将净生成量转换为NR活性单位，如纳摩尔每分钟每毫克蛋白质（nmol/min/mg protein）。

.仪器设备

高速离心机、分光光度计、部分收集器、研钵等。

2.操作方法

1）酶的粗提液：材料可用植物的叶、茎、根，发芽的种子，离体胚和培养的细胞等，以发芽3～5d的小麦幼苗叶片提取较为简便。剪取材料，洗净吸干并切成小块、放在研钵中冷冻30 min后加入少许石英砂及磷酸缓冲提取液（25mmol/L磷酸缓冲液加1mmol/L EDTA和10 mmol/L半胱氨酸，pH8.8），研磨成匀浆（材料多时可用捣碎机），匀浆用2层纱布过滤，清液用30000×g离心15min，得到的上清液即为酶的粗提液。整个过程必须在4℃下进行。

2）酶的活性测定：吸取0.5ml KNO3溶液、0.3ml NADH和0.2ml酶粗提液。混合后在25℃下保温30min。保温结束后，立即加入0.5ml1%氨基苯磺酰胺和0.5ml萘基乙烯二胺水溶液。静置15min以上，用分光光度计在540mm处测定光吸收。以不加NADH的（加入0.3ml水）作空白对照。

样品的光吸收减去空白对照的光吸收等于光吸收的增量。光吸收的增加即此1ml反应液中，在保温30min内，由于酶的作用而增加的NO2-数量。从标准曲线中计算该光吸收的增量相当于多少微克的NO2-。

3）酶的纯化：硝酸还原酶易于失活，近年来常用亲和层析法进行纯化。在粗酶液中加入固体（NH）2SO4，达到20%饱和度，调pH至7.5，置于4℃下15min，15000×g离心15min，弃去沉淀。上清液中再加入固体（NH）2SO4到40%饱和度，4℃下放30min。再用15000 ×g离心15min，弃去上清液。将沉淀物溶解在小量的磷酸钾缓冲液中（25mmol/L，pH 7.5）。然后用Blue Dextran Sepharose进行亲和层析。此外，也可直接用粗酶液上亲和层析柱。