硝酸还原酶活性的测定

一、原理

硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2

NO3-+NADH+H→NO2- +NAD+H2O

产生的NO2- 可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2- 的含量的增加，即表明酶活性的大小。

NO2- 含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。

二、仪器和药品

721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）

0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。

0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。

1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。

1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。

对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。

α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。

NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。

三、实验步骤：

1、 将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。分别置于含有下列溶液的小烧杯中。

（1） 1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml

（2） 0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml

然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。

注意取样前叶子已进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使酶活性降低，此时可于反应溶液中加入30uM3-磷酸甘油醛或1.6-二磷酸果糖，能显著增加NO2的产生。

2、NO2含量的测定

保温30分钟后，分别吸取反应液1ml于试管中，加入对氨基苯磺酸2ml及α–萘胺2ml混合摇匀，静置20分钟生成红色，用比色计进行比色测定。比色用520nm记下光密度读数，从标准曲线上查得的含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO2-微克表示。

3、 绘制标准曲线

测定NO2的对氨基比色法很灵敏，可以检出1ugml的NaNO2含量，故可于0-5ug/ml浓度范围内绘制标准曲线，注意显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关温度，酸浓度等都影响显色温度，同时也影响灵敏，所以标准与样品的测定都要在相同的条件下进行。

吸取不同浓度的NaNO2溶液（如5、5、3、1、0.5、0.1ug/mg）1ml于试管中，加入对氨基苯磺酸试剂2ml及α–萘胺试剂2ml，混合均匀，静置20分钟（或于一定的温度的水浴中保温20分钟），于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光密度，然后于坐标纸上绘制光密度—浓度曲线，以光密度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。