原理
硝酸还原酶（NR）催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对－氨基苯磺酸（或对－氨基苯磺胺）及α－萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下：
材料与仪器
水稻 小麦叶片
硝态氮标准母液 磷酸缓冲液 氨基苯磺胺
冷冻离心机 分光光度计 电子分析天平 冰箱 恒温水浴 研钵 剪刀 离心管 具塞试管 移液管 洗耳球
硝态氮标准母液 磷酸缓冲液 氨基苯磺胺
冷冻离心机 分光光度计 电子分析天平 冰箱 恒温水浴 研钵 剪刀 离心管 具塞试管 移液管 洗耳球
步骤
一、材料仪器设备及试剂
1. 材料：水稻或小麦的叶片、幼穗等。
2. 仪器设备：冷冻离心机；分光光度计；电子分析天平；冰箱；恒温水浴；研钵；剪刀；离心管；具塞试管；移液管；洗耳球。
3. 试剂及配制:
1μg·ml－1亚硝态氮标准母液配制：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g，溶于蒸馏水后定容至1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1μg·ml－1的标准液。
0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液配制：称取Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g，加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
1％对－氨基苯磺胺（W∕V）溶液配制：称取1.0g磺胺溶于100ml 3mol·L－1HCl中（25ml浓盐酸加蒸馏水定容至100ml即为3mol·L－1HCl）。
0.02％（W∕V）萘基乙烯胺溶液配制：称取 0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml蒸馏水中，贮存于棕色瓶中。
0.1 mol·L－1KNO3溶液配制：称取 2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液。
0.025 mol·L－1pH8.7的磷酸缓冲液配制：称取 8.8640g Na2HPO4·12H2O，0.0570g
K2HPO4·3H2O溶于1000ml无离子水中。
提取缓冲液配制：称取 0.1211g半胱氨酸，0.0372gEDTA溶于100ml 0.025 mol·L－1pH8.7的磷酸缓冲液中。
2mg·ml－1NADH（辅酶Ⅰ）溶液配制： 4mg NADH溶于2ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液中（临用前配制）。
二、实验步骤
1. 亚硝态氮标准曲线制作
（1）取7支15ml刻度试管，编号，按下表配制含量为0－2.0μg的亚硝态氮标准液。
加入表中试剂后，摇匀，在25℃下保温30min，然后以0号管为空白对照，在520nm波长处测定吸光度（A）值 。
（2） 标准曲线绘制
以1～6号管亚硝态氮含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
2. 样品中硝酸还原酶活力测定
（1） 酶的提取
称取0.5g鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中，在4℃，4000r/min下离心15min，上清液即为酶提取液。
（2） 酶促反应
取酶液0.4ml于10ml试管中，加入1.2ml 0.1 mol· L－1KNO3磷酸缓冲液和0.4ml NADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液代替。
（3） 酶活性测定
保温结束后立即加入1ml 1﹪磺胺溶液终止酶反应，再加1ml 0.02﹪萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000 r / min下离心15min，以空白管为对照，取上清液在520nm波长处测定吸光度（A）值。
三、 酶活性计算
根据样品所测得的吸光度（A）值，从标准曲线查出反应液中亚硝态氮含量，按下公式计算样品中酶活性：
1. 材料：水稻或小麦的叶片、幼穗等。
2. 仪器设备：冷冻离心机；分光光度计；电子分析天平；冰箱；恒温水浴；研钵；剪刀；离心管；具塞试管；移液管；洗耳球。
3. 试剂及配制:
1μg·ml－1亚硝态氮标准母液配制：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g，溶于蒸馏水后定容至1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1μg·ml－1的标准液。
0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液配制：称取Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g，加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
1％对－氨基苯磺胺（W∕V）溶液配制：称取1.0g磺胺溶于100ml 3mol·L－1HCl中（25ml浓盐酸加蒸馏水定容至100ml即为3mol·L－1HCl）。
0.02％（W∕V）萘基乙烯胺溶液配制：称取 0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml蒸馏水中，贮存于棕色瓶中。
0.1 mol·L－1KNO3溶液配制：称取 2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液。
0.025 mol·L－1pH8.7的磷酸缓冲液配制：称取 8.8640g Na2HPO4·12H2O，0.0570g
K2HPO4·3H2O溶于1000ml无离子水中。
提取缓冲液配制：称取 0.1211g半胱氨酸，0.0372gEDTA溶于100ml 0.025 mol·L－1pH8.7的磷酸缓冲液中。
2mg·ml－1NADH（辅酶Ⅰ）溶液配制： 4mg NADH溶于2ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液中（临用前配制）。
二、实验步骤
1. 亚硝态氮标准曲线制作
（1）取7支15ml刻度试管，编号，按下表配制含量为0－2.0μg的亚硝态氮标准液。
加入表中试剂后，摇匀，在25℃下保温30min，然后以0号管为空白对照，在520nm波长处测定吸光度（A）值 。
（2） 标准曲线绘制
以1～6号管亚硝态氮含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
2. 样品中硝酸还原酶活力测定
（1） 酶的提取
称取0.5g鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中，在4℃，4000r/min下离心15min，上清液即为酶提取液。
（2） 酶促反应
取酶液0.4ml于10ml试管中，加入1.2ml 0.1 mol· L－1KNO3磷酸缓冲液和0.4ml NADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液代替。
（3） 酶活性测定
保温结束后立即加入1ml 1﹪磺胺溶液终止酶反应，再加1ml 0.02﹪萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000 r / min下离心15min，以空白管为对照，取上清液在520nm波长处测定吸光度（A）值。
三、 酶活性计算
根据样品所测得的吸光度（A）值，从标准曲线查出反应液中亚硝态氮含量，按下公式计算样品中酶活性：
来源：丁香实验
