硝酸还原酶活力的测定（离体法）

一、原理

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以Nμg·g﹣1·h﹣1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。

二、仪器与用具

离心机；分光光度计；冰箱；研钵；试管等用具同活体法。

三、试剂

1. 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液；0.1mol/L KNO3磷酸缓冲液；1%（W/V）对–氨基苯磺酸溶液；0.2%（W/V）α-萘胺溶液（上述溶液配法同活体法）。

2. NADH2溶液：称取2.0mg NADH2溶于1ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中（冰箱贮存可用一星期）；

3. 提取缓冲液（25mmol/L的磷酸缓冲液、5mmol/L半胱氨酸、5mmol/L EDTA-Na2混合液）：取250ml 0.1mol/L磷酸缓冲液，加半胱氨酸0.61g；EDTA-Na2 1.86g，溶解后用KOH溶液调pH至7.5，定容1000ml。

四、方法

1. 取材料2g，洗净剪碎，放在研钵中置低温冰箱冷冻30min。取出在冰浴中加少量石英砂和提取缓冲液（玉米、小麦、水稻分别按每克鲜重1ml，2ml和4ml分两次加入）。研磨为匀浆，低温离心5min（4000r/min）。上清液即为粗酶提取液。上述操作尽量在冰浴中进行。

2. 取0.4ml粗酶提取液，1.2ml 0.1mol/L KNO3磷酸缓冲液，0.4ml NADH2溶液加入备好的刻度试管中混匀，在30℃下保温30min，对照不加NADH2，以0.4ml蒸馏水代替。

3. 保温后立即加1ml对-氨基苯磺酸溶液终止反应，加1mlα-萘胺溶液，显色20min，在台式离心机上离心10min，上清液在分光光度计上测波长540nm处光密度。

4. 标准曲线制作和结果计算同活体法。

五、注意事项

1. 硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防止亚硝酸盐还原为氨。加异丙醇可增加组织对NO3－和NO2－的透性，厌氧条件可防止氧竞争还原吡啶核苷酸。

2. 取样前材料应照光3h以上，大田取样在上午9点后为宜，阴雨天不宜取样。取样部位应尽量一致。

3. 配好的KNO3磷酸缓冲液应密闭低温保存，否则易滋生微生物将NO3－还原，使对照吸光值偏高。

4. 从显色到比色时间要一致，过短过长对颜色有影响。