植物体内硝酸还原酶活力的测定(活体法)
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【原理】
硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：
产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下：
生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以Nμg·g﹣1·h﹣1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。
【仪器与用具】
分光光度计；真空抽气泵（或20ml注射器筒）；天平；单面刀片；保温箱（或恒温水浴）；刻度试管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。
【试剂】
亚硝酸钠标准液 称取分析纯NaNO2 0.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀释定容至1000ml，即为每ml含NaNO2 5μg（亚硝态氮近似1μg/ml）的标准液。
0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液：K2HPO4 19.24g，KH2PO4 2.2g，加水溶解后定容至1000ml。
1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液：称取1.0g加入25ml浓HCl中，用蒸馏水定容至100ml。
0.2%（W/V）α-萘胺溶液：称取0.2gα-萘胺溶于25ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至100ml。
30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
KNO3（0.1mol/L）、异丙醇（1% V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称3.03g KNO3溶于300ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加3ml异丙醇混匀。
【方法】
标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0~2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程。
表13-1 各试剂加入顺序
2. 酶反应和酶活性测定
（1）取样 将材料（小麦、玉米等作物叶片）洗净，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干。在叶片中部打取直径1cm的圆片（或剪成0.5~1.0cm2的小块），混匀后每个样品称0.5~1.0g 3份，放入试管并编号。
（2）反应 向各试管加入KNO3·异丙醇·磷酸缓冲液混合液9ml，其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混匀作对照。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶片沉在管底。将各试管置30℃下于黑暗处保温30min，分别向处理管加1.0ml三氯乙酸，摇匀终止酶活性。
（3）比色 将各试管静置2min，吸取上清液2ml加入另一组试管，以对照管做参比，按标准曲线做法进行显色测定，并计算酶活性（Nμg·g﹣1·h﹣1）。
式中 C—反应液催化产生的亚硝态氮总量（μg）；
V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）；
V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml）；
W—样品重量（g）；
t—反应时间（h）。
