简介
植物根系吸收的 NO3-必须经代谢性还原才能被植物体进一步利用。硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写 NR）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。NR 与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法，了解硝酸还原酶的特性。
原理
硝酸还原酶活性的测定的基本原理是硝酸还原酶催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的 NO2- 可以从植物组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中 NO2- 含量的增加，即表明酶活性的大小。
在一定条件下，NO2- 的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。NO2- 含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）发生重氮反应，生成的重氮化合物又 a-萘胺（或 N-萘基乙二胺盐酸盐）生成红色偶氮化合物，可在 540 nm 下比色测定。反应如下：
硝酸还原酶活性一般釆用活体法或离体法测定。离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中 NADH 受损失，必需外加 NADH 方可测定。活体法是直接用鲜活组织进行测定，环境中的 NO3- 进入细胞后，被硝酸还原酶还原成 NO2- 并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中 NO2- 的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH 可由代谢反应不断生成，无须外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应做一定量的重复。本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。
材料与仪器
材料：可选用小麦、玉米、白菜、油菜、烟叶等作物的新鲜叶片。
试剂：
① NaNO2 标准液：精确称取 NaNO2 0.1000 g，用水溶解后定容至 100 mL，吸取此液 5 mL，用水稀释定容至 1 000 mL，即为 5 μg·mL-1 的 NaNO2 标准液。
② 0.1 mol·L-1 pH7.5 磷酸缓冲液：
A 液（0.2 mol·L-1 Na2HPO4）：称取 Na2HPO4·2H2O（A.R）35.61 g，用蒸馏水溶解并定容至 1 000 mL；
B 液(0.2 mol·L-1 NaH2PO4)：称取 NaH2PO4·H2O（A.R）27.6 g，用蒸馏水溶解并定容至 1 000 mL；
取 A 液 84.0 mL 和 B 液 16.0 mL，混匀，加蒸馏水 100 mL。必要时用酸度计测定其 pH，并用 HC1 或 NaOH 溶液校正至 pH7.5。
③ 0.1 mol·L-1 KNO3 溶液：称取 2.5275 g KNO3（A.R）溶于磷酸缓冲液并定容至 250 mL。
④ 1.0% 对-氨基苯磺酸溶液：称取 1 g 对-氨基苯磺酸，加 25 mL 浓盐酸，用水定容至 100 mL。
⑤ 0.2% a-萘胺溶液：称取 0.2 g a-萘胺，加 25 mL 冰乙酸，用水定容至 100 mL。
器材：
① 天平
② 真空泵和真空干燥器
③ 离心机
④ 20 mL 刻度试管
⑤ 50 mL 三角瓶
⑥ 水浴锅
⑦ 恒温箱
⑧ 分光光度计
⑨ 5 mL、2 mL、1 mL 移液管
步骤
硝酸还原酶活性的测定的基本过程可分为如下几步：
1. 标准曲线的制作：取 6 支干净试管，编号，按表 7-1 顺序加入试剂。
| 项目 | 试管号 | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| NaNO2 标准液/mL | 0 | 0.4 | 0.8 | 1.2 | 1.6 | 2.0 | |
| 试剂 | 蒸馏水/mL | 2.0 | 1.6 | 1.2 | 0.8 | 0.4 | 0 |
| 1% 对-氨基苯磺酸溶液/mL | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | |
| 0.2% a-萘胺溶液/mL | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | |
| NaNO2 含量/μg | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
摇匀后在 30 ℃ 保温 20 min，然后在 520 nm 波长下测定光密度，以亚硝酸含量为横坐标，光密度为纵坐标绘制标准曲线。
2. 酶反应和酶活性的测定：将实验材料（如白菜叶片）用水洗净，再用蒸儲水冲洗，然后用纱布或滤纸吸干。将材料剪成 1 cm × 1 cm 左右的小块，混合均匀后分别称取 4 份，每份 1 g，然后分别放入 4 只 50 mL 的三角瓶中，编号后按表 7-2 加入各种试剂。
| 试剂 |
三角瓶编号 |
|||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 0.1 mol·L-1 pH7.5 磷酸缓冲液 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 0.1 mol·L-1 KNO3 溶液 | 5.0 | 5.0 | ||
| 蒸馏水 | 5.0 | 5.0 | 0 | 0 |
3. 摇匀后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气 10 min。放气后叶片变软并沉入溶液。将三角瓶取出放入恒温箱，在 30 ℃、暗条件下保温 30 min。
4. 分别吸取上清液 2 mL 于另一试管中，各加入 4 mL 1% 对-氨基苯磺酸溶液和 4 mL 0.2% α-蔡胺溶液，30 ℃ 保温显色 20 min 后，测定 520 nm 波长下的光密度。用 3、4 号管溶液 光密度平均值减去 1、2 号管溶液的光密度平均值，得到的值在标准曲线上查出相应的 NaNO2 含量（μg）。
5. 结果与计算：把在标准曲线上查得的 NaNO2 含量代入下式，计算硝酸还原酶活性。
NR 活性（μg NaNO2·g-1 鲜重·h-1）= NaNO2 （μg）× 反应液的总体积/样品重（g）× 时间（h）
注意事项
1. 真空抽气可在真空恒温箱中进行（抽气至 700 mm Hg 柱，10 min），也可以在真空干燥器中接真空泵抽气。
2. 硝酸盐还原酶反应要在黑暗条件下进行，防止叶绿体在光合作用时产生的铁氧还蛋白还原 NO2-，以保证测定结果的准确。
3. 硝酸还原酶是诱导酶。光照是其诱导条件之一，所以应在光合作用进行了一段时间以后（3 h）采样，田间采样应在早晨 9 点以后。
4. 无机磷对硝酸还原酶活力有促进作用，所以常用磷酸缓冲液。
5. 在配制标准溶液时，加入 NaNO2 标准液和蒸馅水后要摇匀。显色时，加入 1% 对-氨基苯磺酸溶液后应充分摇匀。
6. 从显色到比色的实验要保持一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。
来源：丁香实验
