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活体法检测物体内硝酸还原酶活性实验

相关实验:活体法检测物体内硝酸还原酶活性实验

最新修订时间:

材料与仪器

步骤

一、材料仪器设备及试剂

1. 材料:水稻或小麦的叶片、幼穗等。

2. 仪器设备:真空抽气泵;真空干燥器;小烧杯;玻璃瓶塞;其它用具同离体法。

3. 试剂及配制:

亚硝酸钠标准液(与离体法相同)。

0.1mol·L-1KNO3(配制方法同离体法)。

1%磺胺(配制方法同离体法);

0.02%萘基乙烯胺(配制方法同离体法)。

30%三氯乙酸溶液配制:称取30g三氯乙酸,水溶后定容至100ml。

二、实验步骤

1. 标准曲线制作 ( 同离体法)。

2. 酶促反应

(1)称取作物叶片1.0~2.0g四份,剪成1cm左右的小段,分放于四个小烧杯中,用直径略小于烧杯直径的玻璃瓶塞将材料全部压于杯底,其中一份作对照,另外三份作酶活性测定用。

(2) 先向对照杯中加入1ml 30%三氯乙酸,然后各杯中都加入9ml 0.1 mol·L-1KNO3溶液,混匀后立即放入干燥器中,抽气1min再通入空气,再抽真空,反复几次,以排除组织间隙的气体,至叶片完全软化沉入杯底,以便底物溶液进入组织。最后通入氮气密封后,在25℃黑暗中反应半小时,再分别向测定杯(对照杯除外)加入1ml 30%三氯乙酸终止酶反应。

3. 测定

将各杯摇匀静置2分钟后,各取2ml反应液到试管中,加入1ml 1﹪磺胺和1ml 0.02﹪萘基乙烯胺,摇匀显色15min后,再倒入离心管中,在4000 r / min下离心15min,取上清液在520nm波长处测定吸光度(A)值。并从标准曲线查出反应液中的亚硝态氮含量(μg)。

三、酶活性计算 ( 同离体法)。


注意事项

1. 硝酸还原酶容易失活,离体法测定时,操作应迅速,并且在4℃下进行。

2. 取样宜在晴天进行,最好提前一天施用一定量的硝态氮肥,取样部位应一致。

3. 硝酸盐还原过程应在黑暗中进行,以防亚硝酸盐还原为氨。

4. 从显色到比色时间要一致,显色时间过长或过短对颜色都有影响。

来源:丁香实验

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