间接ELISA中试剂的配制及反应流程
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实验试剂
1. 包被缓冲液：(0.05 mol/L，pH 9.6的碳酸盐缓冲液)
2) 0.2M Na2 HPO4 .12H2 O (7.1628g Na2 HPO4 .12H2 O 100 ml双蒸水)
3) 1% TMB (10mgTMB 200μl无水乙醇 800μl水)
分别取A液 24.3ml，B液25.7ml，混合后加入50ml 双蒸水。然后从中取出9.9ml移入新试管中，再加入100μl C液，最后加入10μl 30% H2 O2 。
注意：30% H2 O2 溶液应避光保存。C液和H2 O2 溶液最好在临用前加入。
8. 终止液(2M的H2 SO4 )
11 ml浓硫酸 89ml水
实验步骤
1. 包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度(如2μg/ml)，每孔加入100μl稀释好的抗原，于4℃下过夜。
2. 洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟。洗涤时将板子放在96孔板振荡器上，600转/分钟。
3. 封闭：每孔加入300μl封闭液，放于湿盒中，37℃，孵育2h。注意要将湿盒提前放入37℃温箱中预热。
5. 加一抗，即被检血清：每孔加入用一抗稀释液稀释好的被检血清100μl，放于湿盒中，37℃，孵育1h。注意设置阳性和阴性对照。
7. 加酶标二抗：按商品化酶标二抗的推荐浓度或者预实验中较好的浓度稀释二抗，每孔加100μl，放于湿盒中，37℃，孵育1h。
11. 读数：将ELISA反应板放入酶标仪中，读取OD值。注意酶标仪应提前15分钟打开预热，还有读数前最好用酒精棉球擦拭反应板底部，以除去指痕等污渍。
