关于简并引物PCR问题！

小弟接触简并引物PCR已经有一段时间了，虽然说不上是老手，但是至少不是新手了，对于简并引物PCR有了初步的了解。在dxy里，看了很多这方面的帖子，逐步认识了这个试验。但是我在试验过程中发现，还是有很多的问题我解决不了，我曾经发过关于简并引物PCR的帖子，但是回答的人几乎没有，我不知道是这个试验本生就很难，还是什么别的，我反正觉得特难！

我的模板是细菌基因DNA，我用生工的UNIQ－10柱式kit，得到的基因组DNA是20kb左右，而且我用其他文献发表的用proteinK和SDS法，也是同样大小。由于有人说，至少是20kkb，所以我真是怀疑模板大小问题。但是抽提过程中，十分小心，不可能会出现断裂，电泳宣示十分好！ 我在简并引物PCR时，模板一般是200ng左右。

我用了保生的PCR酶rTaq，很常规的酶。50微升的体系，5微升的buffer，其中已经有镁离子了。dNTP是4微升，引物浓度为1微摩尔。引物如下：

上游引物：
Maltooligosyl trehalose synthase (MTSase):
Primer1：上游引物：THDTKR
5‘－AC(G/C)CACGA(T/C)AC(G/C)AAGCG(C/A/G)－3’
说明如下：为了降低引物的简并性，并且3‘端不能有简并性，故对于3‘端我拆分开来，具体见下：
1．5‘－AC(G/C)CACGA(T/C)AC(G/C)AAGCGC－3’
2．5‘－AC(G/C)CACGA(T/C)AC(G/C)AAGCGA－3’
3．5‘－AC(G/C)CACGA(T/C)AC(G/C)AAGCGG－3’


引物 长度 GC含量 退火温度
5‘－ACGCACGATACGAAGCGC－3’ 18 61 53
5‘－ACGCACGATACCAAGCGC－3’ 18 61 53
5‘－ACGCACGACACGAAGCGC－3’ 18 67 55
5‘－ACGCACGACACCAAGCGC－3’ 18 67 55
5‘－ACCCACGATACGAAGCGC－3’ 18 61 53
5‘－ACCCACGATACCAAGCGC－3’ 18 61 53
5‘－ACCCACGACACGAAGCGC－3’ 18 67 55
5‘－ACCCACGACACCAAGCGC－3’ 18 67 55

5‘－ACGCACGATACGAAGCGG－3’ 18 61 53
5‘－ACGCACGATACCAAGCGG－3’ 18 61 53
5‘－ACGCACGACACGAAGCGG－3’ 18 67 55
5‘－ACGCACGACACCAAGCGG－3’ 18 67 55
5‘－ACCCACGATACGAAGCGG－3’ 18 61 53
5‘－ACCCACGATACCAAGCGG－3’ 18 61 53
5‘－ACCCACGACACGAAGCGG－3’ 18 67 55
5‘－ACCCACGACACCAAGCGG－3’ 18 67 55

5‘－ACGCACGATACGAAGCGA－3’ 18 56 50
5‘－ACGCACGATACCAAGCGA－3’ 18 56 50
5‘－ACGCACGACACGAAGCGA－3’ 18 61 53
5‘－ACGCACGACACCAAGCGA－3’ 18 61 53
5‘－ACCCACGATACGAAGCGA－3’ 18 56 50
5‘－ACCCACGATACCAAGCGA－3’ 18 56 50
5‘－ACCCACGACACGAAGCGA－3’ 18 61 53
5‘－ACCCACGACACCAAGCGA－3’ 18 61 53


下游引物：
Maltooligosyl trehalose trehalohydrolase(MTHase)
Primer2：DVVYNH
5’－GTGGTTGTA(G/C)AC(G/C)AC(A/G)TC－3’
1．5’－GTGGTTGTA(G/C)AC(G/C)ACATC－3’
2．5’－GTGGTTGTA(G/C)AC(G/C)ACGTC－3’


引物 长度 GC含量 退火温度
5’－GTGGTTGTAGACGACATC－3’ 18 50 48
5’－GTGGTTGTAGACGACGTC－3’ 18 56 50
5’－GTGGTTGTAGACCACATC－3’ 18 50 48
5’－GTGGTTGTAGACCACGTC－3’ 18 56 50
5’－GTGGTTGTACACGACATC－3’ 18 50 48
5’－GTGGTTGTACACGACGTC－3’ 18 56 50
5’－GTGGTTGTACACCACATC－3’ 18 50 48
5’－GTGGTTGTACACCACGTC－3’ 18 56 50


ATC和GTC每一千个分别出现个数是2.1和56.4， 由于3'端最后一个碱基没有简并性就行，所以合成一条。


我想用降落pcr
94 10min

94 1min
53 1min
72 1min 2cycles

94 1min
52 1min
72 1min 2cycles

94 1min
51 1min
72 1min 2cycles

........

94 1min
46 1min
72 1min 2cycles

94 1min
45 1min
72 1min 20cycles

72 5min
对于94度10分钟，我是看了帖子做的调整。


结果如下：没有加模板的对照还没有出来结果，正在电泳。而加了模板的，引物1和4只有一条带在上样缓冲前面。引物2和4，除了样缓冲带前面有一个亮带外，还有很多的条带，不是很大。也就600bp以内吧。而引物3和4和引物2和4的结果类似，但是非特异性条代最多，2000bp以内都有。
各位大侠，我真的很恳切的求助，帮忙小弟一把！多谢了！！！