叶绿素含量的测定（分光光度法）

原理

叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，可用以下联立方程求叶绿素溶液中的叶绿素a、b的含量。

D663=82.04Ca9.27Cb……………………(1)
D645=16.75Ca45.6Cb……………………(2)
式中D663、D664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的光密度；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)；82.04、9.27分别为叶绿素a、b在波长663nm时的比吸收系数，16.75、46.6分别为叶绿素a、b在波长645nm时的比吸收系数。

解联立方程(1)、(2)则得：
Ca=0.0127D663-0.00269D645……………(3)
Cb=0.0229D645-0.00468D663……………(4)

如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为：
Ca(mg/L)=12.7D663-2.69D645…………(5)
Cb(mg/L)=22.9D645-4.68D663…………(6)
叶绿素总量C(mg/L)=CaCb=20.2D6458.02D663……(7)

叶绿素总量也可根据下式求导
D652=34.5×C……………(8)
652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，34.5为叶绿素a、b在波长652nm处的吸收系数。
DC=D652/34.5(g/L)Cd
DC=D652×1000/34.5(mg/L)………(9)

因此，利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(9)式可计算叶绿素总量。

叶绿体色素的提取液中除含有叶绿素a与b外，还含有叶黄素和胡萝卜素，因为叶黄素和胡萝卜素的吸收光谱均在蓝光区，故不会干扰叶绿素含量在红光区的分光光度法测定。

器材与试剂

722分光光度计，叶绿体色素提取所需器材。

方法与步骤

1. 提取叶绿素。

2. 测定光密度。

在1cm比色杯中，注入叶绿素提取液(浓度大时需稀释)。另以叶绿素提取介质作为参比溶液注入同样的比色杯中。根据实验要求，选用相应的波长(测总量选用652nm，测叶绿素a、b含量及总量选用663nm和645nm)，在分光光度计上测定光密度。

3. 计算结果：把测定的光密度代入上述公式可求出比色杯中的叶绿素含量。如要计算样品中叶绿素含量时，需要考虑稀释因子。

样品中叶绿素含量(mgChl/g鲜重或mgChl/ml叶绿体)

D=比色杯中叶绿素含量×稀释倍数/样品量(g鲜重或ml叶绿体)

注意事项

用分光光度法测定物质含量时，分光光度计的波长调节要准确，参比杯与测定杯的透光率要一致。