实验33 叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）

实验33 叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）

原理

　　如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert—Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。

　　如图9叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。

　　根据Lambert—Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光度A之间有如下的关系（参阅实验86）：

A₁ =C_a ·k_a1 C_b ·k_b1 (1)

A₂ =C_a ·k_a2 C_b ·k_b2 (2)

　　式中：C_a 为组分a的浓度，g/L。

　　C_b 为组分b的浓度，g/L。

　　A₁ 为在波长λ₁ （即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。

　　A₂ 为在波长λ₂ （即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。

　　k_a1 为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长

　　λ₁ 时的吸光度A值。

　　k_b2 为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ₂ 时的吸光度A值。

　　k_a2 为组分a（浓度为1g/L）在波长λ₂ 时的吸光度A值。

　　k_b1 为组分b（浓度为1g/L）在波长λ₁ 时的吸光度A值。

　　从文献中可以查得叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：

　　将表中数值代入上式(1)、(2)，则得：

A₆₆₃ =82.04×C_a 9.27×C_b

A₆₄₅ =16.75×C_a 45.60×C_b

　　经过整理之后，即得到下式：

C_a =0.012 7 A₆₆₃ —0.002 69 A₆₄₅

C_b =0.022 9 A₆₄₅ —0.004 68 A₆₆₃

　　如果把C_a ，C_b 的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：

C_a =12.7A₆₆₃ —2.69A₆₄₅ (3)

C_b =22.9A₆₄₅ —4.68A₆₆₃ (4)

C_t =C_a C_b =8.02A₆₆₃ 20.21A₆₄₅ (5)

　　(5)式中C_t 为总叶绿素浓度，单位为mg/L。

　　利用上面(3)、(4)、(5)式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度。

　　注：一般大学教学实验室所用的分光光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽值要比中级类型的751型大得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663─645nm），难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就更差了。根据公式计算往往会得到叶绿素a∶b值小于1，这就不很奇怪了。除向学生说明其中原因外，还可以在实验前对仪器的波长进行校正，使标称波长与实际波长一致。校正可用纯的叶绿素a和b进行，分别在波长650─670nm和630梍650nm之间，每隔1─2nm测定叶绿素a或b的吸光度A，以确定叶绿素a和b的吸收峰的波长。如果测得的峰值与文献上的峰值663nm和645nm不同，可按照仪器说明书步骤进行校正，或者更方便的方法可以打开仪器盖子，松动波长刻度盘紧固螺丝，调节刻度盘使波长至正确值，而后旋紧螺丝复原仪器。

　　为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的用量是很少的，用纸层析法很快就能分离制得。取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含0.5%丙醇的石油醚。层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b，注意剪时尽量避开有可能遭污染的色区。最后分别浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a和b。