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叶绿素a、b含量的测定(分光光度法)

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6713

一、原理

叶绿素a、b在长波方面最大吸收峰分别位于663nm和645nm。

同时在该波长时,叶绿素a、b的比吸收系数K为已知,我们即可以根据Lambert-Beer定律,列出浓度C与光密度D之间的关系式:

D663=82.04Ca+9.27Cb …………………………………(1)

D645=16.75Ca+45.6Cb …………………………………(2)

(1)、(2)式中的D663、D645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的光密度。

Ca、Cb为叶绿素a、b的浓度,单位为每升克数。

16.75、45.6为叶绿素a、b在波长645nm时的比吸收系数。

解方程式(1)(2),则得:

此时,CT为总叶绿素浓度,CA 、CB为叶绿素a、b的浓度,单位为每升毫克,利用上面(3)(4)(5)式,即可以计算a、b总叶绿素的浓度。

二、仪器药品

扭力天平 剪刀 研钵 移液管 漏斗 大试管 丙酮 碳酸钙 石英砂 721型分光光度计(如有其他精密型号的分光光度计则更好)

三、实验步骤

1、提取叶绿素

从植株上选取有代表性的叶片数张,于扭力天平上称取0.1g鲜重,剪碎后置于研钵中,加蒸馏水5-6ml,碳酸钙少许及适量的石英砂,仔细研磨成匀浆,用蒸馏水定容到10ml。然后用移液管吸取1.5ml,置于一大试管中,加入80%丙酮6ml,摇动试管,促使叶绿素溶于丙酮中,静置片刻使残渣沉于管底,将上面绿色上清夜过滤在另一干净的试管中,此即为叶绿素丙酮溶液,做测定用。

2、测量光密度

取一光径为1cm的比色杯,注入上述叶绿素丙酮溶液,另以80%丙酮注入同样的比色杯中,作为空白对照,与663nm和645nm波长下读取光密度,读数时必须将灵敏度旋钮拨到3位置,以使狭缝最小,减少杂散波长,提高测量准确性。

3、结果计算

根据测量得到的光密度D663 、D645,代入(3)式计算溶液中叶绿素a的含量;代入(4)式中计算得到叶绿素b的含量,代入(5)式计算得到叶绿素总含量。

最后计算叶子样品中叶绿素含量时,需要考虑稀释因子,则得到: V1为定容体积;V2为被取体积;V3为加入丙酮后的体积

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