叶绿素a、b含量的测定（分光光度法)

一、原理

叶绿素a、b在长波方面最大吸收峰分别位于663nm和645nm。

同时在该波长时，叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert－Beer定律，列出浓度C与光密度D之间的关系式：

D663＝82.04Ca＋9.27Cb …………………………………（1）

D645＝16.75Ca＋45.6Cb …………………………………（2）

（1）、（2）式中的D663、D645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的光密度。

Ca、Cb为叶绿素a、b的浓度，单位为每升克数。

16.75、45.6为叶绿素a、b在波长645nm时的比吸收系数。

解方程式（1）（2），则得：

此时，CT为总叶绿素浓度，CA 、CB为叶绿素a、b的浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算a、b总叶绿素的浓度。

二、仪器药品

扭力天平 剪刀 研钵 移液管 漏斗 大试管 丙酮 碳酸钙 石英砂 721型分光光度计（如有其他精密型号的分光光度计则更好）

三、实验步骤

1、提取叶绿素

从植株上选取有代表性的叶片数张，于扭力天平上称取0.1g鲜重，剪碎后置于研钵中，加蒸馏水5－6ml，碳酸钙少许及适量的石英砂，仔细研磨成匀浆，用蒸馏水定容到10ml。然后用移液管吸取1.5ml，置于一大试管中，加入80％丙酮6ml，摇动试管，促使叶绿素溶于丙酮中，静置片刻使残渣沉于管底，将上面绿色上清夜过滤在另一干净的试管中，此即为叶绿素丙酮溶液，做测定用。

2、测量光密度

取一光径为1cm的比色杯，注入上述叶绿素丙酮溶液，另以80％丙酮注入同样的比色杯中，作为空白对照，与663nm和645nm波长下读取光密度，读数时必须将灵敏度旋钮拨到3位置，以使狭缝最小，减少杂散波长，提高测量准确性。

3、结果计算

根据测量得到的光密度D663 、D645，代入（3）式计算溶液中叶绿素a的含量；代入（4）式中计算得到叶绿素b的含量，代入（5）式计算得到叶绿素总含量。

最后计算叶子样品中叶绿素含量时，需要考虑稀释因子，则得到： V1为定容体积；V2为被取体积；V3为加入丙酮后的体积