Wnt/β-catenin信号通路在实验性大鼠肝癌形成过程中的作用
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Wnt /β-catenin信号转导通路是一条在生物进化中极为保守的通路。在正常的体细胞中，β-catenin只是作为一种细胞骨架蛋白在胞膜处与E-cadherin形成复合体对维持同型细胞的黏附、防止细胞的移动发挥作用。只有当细胞外Wnt信号分子与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合激活胞内的d ishevelled(散乱的)蛋白导致GSK3B失活，使α-catenin避免被磷酸化而遭降解的命运 , β-catenin才能在胞质中积累起来。
当胞质中B-catenin的浓度达到一定水平时, 就可向细胞核转移。在胞核中β-caten in与转录因子家族Tcf /Lefs结合, 可激活cyc linD1 和cmyc等原癌基因而导致细胞的增殖、分化、成熟。显然， 在这条信号通路中β-catenin 发挥了重要作用,其在胞质中积累继而向胞核的转位, 被认为是该信号通路被激活的标志。已有研究证实，Wnt/β-catenin信号通路在人结肠癌、乳腺癌等肿瘤的发生中被激活，但是有关该信号通路在肝癌, 特别是在模型鼠肝癌发生中的作用却少有报道。
本研究中通过建立大鼠的肝癌模型，以Wnt /β-ca ten in 信号通路中的几个关键因子为研究对象， 探讨它们在正常鼠肝、不典型增生鼠肝和肿瘤肝脏中的表达，以期揭示Wnt/β-catenin信号转导通路与肝肿瘤发生的关系，为临床上肝癌的诊治提供新的线索。
1 材料和方法
1. 1 材料
兔抗β- caten in及抗APC 抗体购自武汉博士德生物技术公司。鼠抗cyclin D1 mAb以及PV6001两步法检测试剂盒购自北京中杉生物技术公司。总RNA 提取试剂盒(W6701)购自上海华舜生物工程有限公司。逆转录试剂盒( Reve rtA id HM inus F irst Strand cDNA Synthesis K it) 购自Fermentas公司。PCR 反应试剂盒( DRR01AM ) 购自TaKaRa 公司。50只雄性SD大鼠, 体质量150~ 180 g，由四川大学实验动物中心提供
兔抗β- caten in及抗APC 抗体购自武汉博士德生物技术公司。鼠抗cyclin D1 mAb以及PV6001两步法检测试剂盒购自北京中杉生物技术公司。总RNA 提取试剂盒(W6701)购自上海华舜生物工程有限公司。逆转录试剂盒( Reve rtA id HM inus F irst Strand cDNA Synthesis K it) 购自Fermentas公司。PCR 反应试剂盒( DRR01AM ) 购自TaKaRa 公司。50只雄性SD大鼠, 体质量150~ 180 g，由四川大学实验动物中心提供
1. 2 方法
1. 2. 1 大鼠肝癌模型的建立
参照郑杰等[报道的方法,将二已基亚硝胺( DENA)的水溶液以70 m g /kg的剂量每周灌胃1次, 15周停药。有10只大鼠在造模过程中死亡，其余32只分别在喂药后第1、4、6、8、10、12、14、16周，处死动物，每次处死4 只。每只取不同部位的小块肝组织，分别置于40 g /L 多聚甲醛固定液中固定并液氮冻存。正常对照组8只，不给药。
1. 2. 2 wn t1、β-catenin、APC、cyc lin D1 及c-m yc mRNA 的RT-PCR 检测
引物的设计和合成交由大连宝信生物公司完成，经验证后使用。
扩增wn t1 基因的引物序列为: 5-ATCCTG CAC CTG CGA CTA CAG-3和5-GGC GAC TTC TCG AAGTAG ACC-3，扩增产物长度为432 bp，退火温度为58e 。扩增β-caten in基因的引物序列为: 5-AAG TTC TTG GCT ATTACG ACA-3和5-ACA GCA CCT TCA GCA CTCT-3，扩增产物长度为375 bp, 退火温度为58. 2e 。
扩增APC 基因的引物序列为: 5-CGG AAC ATG CAT GAC TGA GAC-3 和5-GTC ACGAGG TAC GAC CTC AGAT-3，扩增产物长度为310 bp，退火温度为60e 。
扩增cy clin D1基因的引物序列为: 5-CAGAAGTGCGAAGCTTAGGTCT-3 和5-GTA GCA GGA GTA GTC CAGCGG-3，扩增产物长度为440 bp， 退火温度为58e 。
扩增cmyc基因的引物序列为: 5-GGA ACT ATG ACC TCG ACT ACGAC-3和5-ACC ATG TCT CCT ACA GTA GCTC-3，扩增产物长度为186 bp，退火温度为60. 5e 。
扩增内参照B-actin引物的序列为5-CGT TGA CAT CCG TAA CGA CTCC-3和5-ATA GAGCCA CCA TTC CGA CAC AG-3，扩增产物的长度为665 bp， 退火温度为60e 。
总RNA 的提取和cDNA 第1 链的合成严格按照相应的试剂盒中的说明操作。PCR反应条件为: 94e 预变性2 m in， 94e 变性30 s，退火( 依据不同的引物选取不同的温度) 30 s，72e 延伸30 s共进行28个循环后，再于72e延伸5 m in。以预先扩增B-actin基因来证明反转录模板的有效性，并且确认扩增未到平台期，在半定量PCR 反应中对其进行平行扩增作为内参照。
PCR产物经10 g /L琼脂糖凝胶电泳，并以EB染色后，采用IBM 586计算机控制的G el Do c1000成像系统( Bio-Rad，USA)进行图像扫描和分析。mRNA 含量的计算: 用图像分析仪对电泳结果进行扫描， 测定各条带的A 值，将样本条带的积分A 值与相应的B-ac tin mRNA条带的A 值相比较，即为样本mRNA的相对含量。
扩增wn t1 基因的引物序列为: 5-ATCCTG CAC CTG CGA CTA CAG-3和5-GGC GAC TTC TCG AAGTAG ACC-3，扩增产物长度为432 bp，退火温度为58e 。扩增β-caten in基因的引物序列为: 5-AAG TTC TTG GCT ATTACG ACA-3和5-ACA GCA CCT TCA GCA CTCT-3，扩增产物长度为375 bp, 退火温度为58. 2e 。
扩增APC 基因的引物序列为: 5-CGG AAC ATG CAT GAC TGA GAC-3 和5-GTC ACGAGG TAC GAC CTC AGAT-3，扩增产物长度为310 bp，退火温度为60e 。
扩增cy clin D1基因的引物序列为: 5-CAGAAGTGCGAAGCTTAGGTCT-3 和5-GTA GCA GGA GTA GTC CAGCGG-3，扩增产物长度为440 bp， 退火温度为58e 。
扩增cmyc基因的引物序列为: 5-GGA ACT ATG ACC TCG ACT ACGAC-3和5-ACC ATG TCT CCT ACA GTA GCTC-3，扩增产物长度为186 bp，退火温度为60. 5e 。
扩增内参照B-actin引物的序列为5-CGT TGA CAT CCG TAA CGA CTCC-3和5-ATA GAGCCA CCA TTC CGA CAC AG-3，扩增产物的长度为665 bp， 退火温度为60e 。
总RNA 的提取和cDNA 第1 链的合成严格按照相应的试剂盒中的说明操作。PCR反应条件为: 94e 预变性2 m in， 94e 变性30 s，退火( 依据不同的引物选取不同的温度) 30 s，72e 延伸30 s共进行28个循环后，再于72e延伸5 m in。以预先扩增B-actin基因来证明反转录模板的有效性，并且确认扩增未到平台期，在半定量PCR 反应中对其进行平行扩增作为内参照。
PCR产物经10 g /L琼脂糖凝胶电泳，并以EB染色后，采用IBM 586计算机控制的G el Do c1000成像系统( Bio-Rad，USA)进行图像扫描和分析。mRNA 含量的计算: 用图像分析仪对电泳结果进行扫描， 测定各条带的A 值，将样本条带的积分A 值与相应的B-ac tin mRNA条带的A 值相比较，即为样本mRNA的相对含量。
1. 2. 3 β- ca ten in、APC和cyc lin D1表达的免疫组化染色检测
采用PV6001快速两步法进行免疫组化染色, 抗原修复采用微波法， 以0. 01 mo l/L的PBS液替代一抗作为阴性对照。β-caten in染色结果的判断标准，参照文献报道的方法, 从细胞膜、细胞质和细胞核3 个方面来判断其表达的差异性。APC表达的位置在细胞质，cyclin D1表达在细胞质和/或胞核。
