细胞培养板的选择和使用（二）

(一)细胞培养板的密闭和污染问题：

细胞培养板的加样和操作：细胞培养板在进行细胞操作时同样遵循严格无菌的原则，各项操作要保证规范、科学，不对细胞的生长造成额外的影响。这其中最常见的问题就是如何保证加样后细胞的均匀和尽量减少换液对细胞生长状态的影响。

问：96，24孔培养板或培养皿的盖子都很松，这样是方便了透气，但是细菌、霉菌等污染物会不会也随着溜进去呢？

答：1.盖子很松，属于半开放培养，这样的目的是透气（实际上是为了使培养皿外的co2能够与培养皿充分交换，维持培养基的pH值）。

2.凡事有利必有弊，这样当然增加了污染的可能性。此外这样还会使培养皿内的液体蒸发，这对于精确定量的药物来说就显得值得注意了。所以以下二条措施是必须的a培养箱内空气必须清洁（定期紫外线照，酒精擦洗，尽量少开关培养箱）b培养箱内的湿度必须始终保持为100%（培养箱内放置无菌蒸馏水的水槽）。

就好像培养皿，也是一个盖倒扣的容器，也不会污染。主要是因为盖子“L”型边缘产生气流负压的缘故，灰尘上面才附着有微生物，而气流携带的灰尘是无法通过产生负压的盖边缘的。而透气作用只是通过空气的扩散，不会产生气流，所以只会透气不会透菌。

我使用24孔板，在其中的某些孔中有操作(在超净台内)，而其他孔中还有细胞要培养.我很担心这样会污染，不知道要注意什么?大家不知道有什么好的建议。

在超净台内如果操作规范的话应该可以的，我想你可以充分利用培养版的盖子，尽量只暴露要操作的孔，将其他孔用盖子盖起来。这是我的一点粗浅的见解，抛砖引玉吧！

使用前综合考虑一下，充分使用所以的孔；如果只需要使用少数的孔可以只用一边的，其余用盖子盖住，我习惯于先用右侧的孔（右手加样方便）。

其实自己感觉只要注意无菌操作，一般是不会污染的。操作时用几块玻片把板子一侧垫高，不要把盖子全打开，一般没问题。

(二)细胞分布不均及解决办法：

问：我的细胞接种培养板，细胞总是聚集在周边部分，该如何处理啊？我看园子里有的战友的细胞却是聚集在中间，是不是板子的质量问题啊？

答：请问你的细胞是如何混匀的？是滴管吹打还是振荡培养板？如果是后者，而且是转圈摇匀的话，很有可能由于离心力的作用使细胞甩到周边部分，导致细胞中间少，四周多！自己可是试试！

周边一般是相对会多一点，但是中间的数量也不会很少啊~~ 铺板的时候我也没有特异去振荡培养板。

大概是板子的质量问题吧或者是不是铺板时候的细胞密度太低了？我用的corning的板 。

一个好办法：在你培养种板之前，把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和后再取出，种入细胞时力量要轻，可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让细胞悬液流入板孔中，培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振荡，否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。

我今天把培养板放入培养箱里几个小时，适当的把细胞密度加大了一下，另外多加了一点培养液，今晚看细胞铺的挺好的。

我认为有两种可能解决你问题的办法:

1.加入前吹打均匀;

2.从多孔板侧边或底边缓慢加入。

我在做原代培养时也遇到过这种情况，我一直以为培养皿铺胶不均匀会导致这种现象，因为混匀的血管段加入到培养皿中时，在相差显微镜下血管段均匀分布在培养皿中，24h后贴壁的血管段就是周边多，中间相对少些。下次我要试试hkqu战友的方法看能否改变这种现象。谢谢指点！

这种现象很正常呀，不知你仔细观察过没有，孔直径愈小，这个现象越明显，我试过，24、96孔板这种现象不可避免，因为液体的附壁使得孔内培养液不是成一个液平面，而是周边高，就像凹镜一样，而使用这两种孔板由于需要加干预等原因而不能加足量培养液，使得细胞随培养液一起出现“边集”现象，如果为了使孔中央也有均匀细胞而增加接种细胞数量的话，这要看你需要观察何种指标，如果是MTT ，免疫组化的话会因为细胞成层而影响结果。

赞成hkqu战友的建议，个人认为消化细胞时要注意吹打均匀，避免细胞成团，而且孔内培养液量要足够，我一般接种时加足量培养液，加干预时换一次液，干预液加培养液量等于接种时培养液量，这样的话“边集”现象会有所改观，不妨一试。

我想我们做课题，实验的目的是为了验证或探索某些理论，而不是要所谓的“好看”，“美”。还记得鲁迅先生的文章《藤野先生》一文吗？我们很多年以前学过的，藤野先生对鲁迅先生说得话大家不防重温一下，我想这正是我们要学习的地方。

我做的是空斑形成实验，最好是细胞铺成均匀的一层，昨天接种病毒时大部分孔都还好，个别的不太均匀。

现在我细胞实验也做了一段时间了，但在实验中平行组的差距还是比较大。

有时候一组数据大多是差不多的，偏偏会跳出一个相去甚远的数据。

我想应该不是我细胞加入时的问题，因为我的组间差距大是出现在加样的组中，而对照组的数据却相当的稳定。另外，我的样品是完全均匀的液体，照理应该是不会出现上述问题的。

我也出现了这样的问题。我加入细胞的时候是用吸管边吹打边用一毫升的枪加入12孔板中的，可是组内差异仍然很大，想请教一下大家加细胞的时候都有什么方法呀？

我觉得有几点：

1.细胞消化后吹打成单细胞悬液很关键！保证分板时每个孔的细胞数目是一致的！

2.当然还有你的处理因素各个孔之间的平行也很重要，比如说加药时，药物稀释后混匀，保证每个孔的浓度是一致的！

3.再者加细胞和药物时，要试验组和对照组一块轮流加，避免加样先后顺序导致细胞密度和药物浓度的差异！！

吹打已经是均匀了，但是铺板，6孔，24孔总有些不均匀的哦，有点爱往中间集中。而且明明计数好了铺了，长一两天，各个孔密度就有点不一样，对检测有影响，能指教一下，有良策吗？

1.如果用巴氏吸管铺的话，每次吸取的量不要太多，因为吸管内的细胞会自动向下沉，往往第一开始几个孔细胞数多，经常均匀细胞悬液，加液走S型路线。

2.如果用移液器的话，tips要处理下，把尖端去掉避免损伤细胞，这样每一次取液对应一个孔。用tip一对一孔加入比较准确。但也要注意混匀悬液。

3.设立平行组，n要足够大（可以计算一下）。

4.铺板后不要摇，因为摇动会导致细胞向中间聚集。最好铺板一次搞定。

铺板后不要做圆周的晃动，做十字晃动，即上下左右晃动，否则会使细胞旋到当中去。

移液器的枪头沿着培养板壁加，就不会集中到中间了。

(三)6孔板接种和换液：

问：我的细胞传代很正常，但一种到六孔板里（不管加药和对照），总有两三个孔（随机）细胞长得不好，很小，像破碎了。有人遇到过这种情况吗？到底是啥原因呢？请各位指点

答：可能跟你加液的温度有关。如果你细胞刚刚拿出来换液加液，培养基也是从4度冰箱拿出来不久，很容易细胞就会冻死了。建议你最好把培养基先在培养箱里边孵育15min先。

另外，跟你细胞的生长状态也有关。加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。保证细胞状态良好。

或者放在37度水浴锅里孵育也可以，或者是培养板本身的问题，你再换换其他培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了，种板时的血清浓度调高试一下

问：最近几天，我用六孔培养板接种细胞，培养24小时后更换培养基，在更换培养基之前，显微镜观察到细胞贴壁，状态非常的好，更换了培养基后，立即用显微镜观察，发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变得非常小，产生大量的碎片，而另一半的细胞一切正常，异常细胞与正常细胞之间存在一条分水岭，上半个圆是好的，下半个圆就不好，这是怎么一回事？

答：你可以看一下是不是培养板没放水平。有一回我也出现过这种情况。

你的培养液如何，如果培养液过期，细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试一试。

我也经常碰到，我想可能是板的问题，换一个牌子的板或换用培养瓶就没问题了。

不知楼主所需换液的培养板多不多，换培养基的时候如果没有注意风机的影响，特别是所需换液的培养板很多时，容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。如果如此，换液时应该逐个培养板进行，别怕浪费吸管，注意操作的效率！

(四)24孔板接种：

问：我把细胞消化接种到24孔板之后，已经四天了，老是每孔的中间部分长不满，每天换液时都用PBS 清洗，第二天换液时都出现同样的情况，每孔的边缘长的很好，中央大量死细胞，我也不知道是什么原因，请各位高手仁兄给把把脉，先谢过！！！！！！！！

答：是中央长不满，还是中央有和边缘相同密度的细胞，但是大部分都是死细胞？如果是前者，也许不是技术问题，而是物理问题了。

我是选择孔内铺盖玻片，在玻片上种植。每次换液都用PBS洗，必要的步骤吗？另外，也有可能和细胞种类有关或者和培养液有关？

我想你的培养液可能加的太少了。由于表面张力的作用，培养板的边缘液体会向上走，造成培养液面呈现一个凹面（就像量筒的液体凹面一样），中央的细胞正好在凹面的最低处，培养液少，细胞的营养不够，甚至干涸掉，空气中的氧气也会造成损伤，即使有增值过来的细胞也会死掉。

估计你的培养液里可能有贵重的“银子”（因子）啊，想少用点吧，结果就…… ：）

另外，检查一下培养箱底部的水是否少了，如果少了，箱内的空气湿度不够，会造成培养液挥发加快，这样即使刚加的液体不少，过一段时间，由于蒸发，液体量会减少，造成中央干涸。并且这样会改变了培养液的成分浓度，造成渗透压过高。

个人经验认为这是物理问题:24孔板小，细胞接种进去后是很难摇均匀的，结果导致细胞重贴壁后呈现四周密中间稀的状况.

至于中间较多死细胞，如果是悬浮状的话，也一样是物理问题。接种后比较粗暴的碰撞，似乎对摇均匀细胞有一定效果. 

在为多孔板培养的细胞换液时一定要注意，不要把培养基吸得太干，如果完全吸取，很容易造成细胞干涸，这样的话细胞会很快死亡。我有一段时间总是遇到这个问题，一个板子中总有一两个孔出现细胞大量死亡，后来发现是上面的原因。现在我做的时候如果必须把液体吸干，我会一个一个空来吸取，最多一次不超过3孔，然后马上加入液体，同时在作转染时，我会在吸液和加液时将风机关掉，这样基本上会避免细胞死亡。

同时你所说的细胞周围密而中间稀疏，大约有如下原因：

1.培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。

2.细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。

我的细胞在接种在24孔板上时，孔的 周围细胞密集，中间细胞稀少，我试了很多次均如此。请问怎样操作才能使细胞分布均匀？

周围细胞密集，中间细胞稀少

这种情况一般是种板时培养液过少，液面总是呈一凹面，如果液面过低，孔中间就基本上没什么细胞，所以种板时一定不能吝啬培养液，待贴壁后可以用比较少量的培养液处理

周围细胞稀少，中间细胞密集:这种情况一般是种板后过于晃动，特别是旋转着晃动.有人才用十字方向的晃动方法使细胞分散均匀.但我个人认为，将细胞加入孔后，用枪或移液器充分吹打混匀后就不用，也不能再晃动，甚至拿着孔板走路带来的震动都会让细胞往中间集中.

当然，无论是哪种情况，首先都需要保证细胞在种板时时均匀分布的，即种板时的细胞悬液一定要混匀

细胞分布均匀与否有一点很关键，即每种细胞是有个体差异的，别人的细胞操作不一定适合于你.所以要靠自己摸索，且找出专属于自己细胞的一套规律，就我个人而言，有如下经验：

1.所有待接种的细胞悬液在种板前一定要用吸管混匀。

2.按资料记载，24孔板的液体量为1ml，个人也觉得1ml的量足矣。

3.接种时，要慢慢加样，且记得轻微旋转枪头，这样做对细胞均匀分布有一定效果。

4.接种后最好直接放入培养箱让细胞适应培养板这个新的环境，个人认为没有必要在室温放置一段时间。

5.根据细胞的特性，细胞均喜欢聚集在边缘生长，所以我考虑到，你的问题还有可能是接种时的细胞密度不够，导致周边密集，中间稀疏的错觉。你的拌种密度是多少？

另"要慢慢加样，且记得轻微旋转枪头"的意思就是:加样不能太快，避免细胞在一个加样处聚集，且注意在不同的部位进行加样，即边加边活动枪头，人为使细胞趋于均匀分布，我个人觉得有一定的效果，不知这次我解释清楚没有。

(五)96孔板细胞接种换液和收集细胞

问：最近我用96孔培养板培养肿瘤细胞，结果细胞长得不是很理想，不是长得不均匀，就是每个孔细胞生长速度不一样。另外，镜下观察细胞轮廓很不清晰，怎么调焦距效果都不好。（板子是刚拆封的。）不知道怎么回事？ 

答：You should make sure that you triturate the cells very well. If the cells tend to form clumps， use a pasteur pipet and pass the cells several times. Then count the cell using Trypan Blue. Plate 1-undefined10^4 per well， depending on your desired density. Usually， only the 60 wells in the middle should be used for plating cells. Wells on the edge will have a decreased volume of media， so you should not add any cells in there， but you still need to put media or H2O inside those 36 wells. 

首先你要尽可能把消化细胞消化成单个细胞（不要成团），反复吹打，掌握好时间（不同的细胞要摸索的），种细胞时要均匀的吸取，清清的吹打一遍再吸取细胞，这样也许会解决您的问题。我以前也是出现这样问题。后来就很好了！！

种到96孔板的细胞一定要消化成单个细胞，建议用EDTA和胰酶消化。加血清后反复吹打。细胞量尽量少一点。

我一般在铺板时都是用八排枪加样的，感觉效果还不错。首先如楼上所说要把细胞消化的恰到好处，背着光看瓶底细胞都下来后再对着瓶壁吹打几次即可。然后将细胞悬液转移到加样槽中，在加样过程中，要不停的轻轻晃动加样槽，且在每次吸样前都吹打几次，以防细胞不是均匀的分散在培养基中，造成加样不均。加样时使枪头贴着孔壁缓慢加入，使液体自然流满即可。都加完后平稳拿到镜下观察铺的很漂亮的。听别人说铺完后在96孔板的四个角轻轻磕几下，但我试过，这样效果反倒不好！ 

我觉得你的问题可能是消化的不好，我的经验希望能有帮助：

1、对细胞的选择要注意，要选择状态好的细胞，密度要选分布瓶底80％为宜；

2、消化时，不要忘了用PBS（或纯的不含血清的培养基）洗一遍，加0.25％的胰酶1ml消化2-3分钟（不同的细胞有差别，你要摸索），还要不时的活动，让胰酶分布到每个角落，之后倾去胰酶，加3ml培养基（我认为加血清过于粘稠，不宜吹打，加培养基后稀释胰酶可不考虑对细胞的损伤），吹打成单个细胞；

3、接种时要注意细胞密度，多数细胞要求0.5-2的10的4次幂，这也要摸索一下（简单：就是你种一个密度，如果在你测指标时细胞没过多影响结果就行）；

4、周边的孔不要做指标检测孔，你有没有发现周边的孔的细胞2天后状态就明显不好了；

5、接种细胞调整好浓度后，要一边吹细胞悬液一边接种；

6、还有你说看不清细胞，你注意到没有，当把培养板那出孵箱一会，培养板盖就有一层雾，会影响观察细胞，你是不是这个问题？？

问：我在96孔培养板上接种的细胞很均匀，但换液时，我用枪加150ul的培养基加入每个孔内，结果在显微镜下观察周边细胞全被冲到孔中央去了，而中间的细胞层叠成致密的团块.请问这样的细胞对实验有影响吗?有其他的好办法吗? 是3T3-L1前脂肪细胞，要进行诱导分化成成熟脂肪细胞。所以我每次换液总把握不好。请问有谁有这方面的经验吗?

答：我们实验室一般用机械吸引器吸引，吸引器管前面套一个20ul加样器的Tip头，效果不错，操作在无菌台内进行。Tip头剪去尖端后灭菌使用，加液时液体呈滴状滴入，就不会扰动孔底的细胞了。

3T3-L1前脂肪细胞不是贴壁的吗？怎么会这么容易被冲到中间去？

我只听说过第一次把细胞加到孔中的时候很容易让细胞长得不均匀，3T3-L1前脂肪细胞要是贴壁了不容易被冲走了吧，要不然就不要用胰酶消化了，呵呵！！

建议：加液的时候沿着边轻轻的加入，动作柔和，可以避免冲动细胞；去液的时候直接甩板，方便快捷。

去液的时候不建议直接甩板，容易污染。可以剪掉tip尖，不能直接冲细胞，沿孔壁轻轻加入，液体提前在孵箱里预热10分钟，有时候液体凉也会使细胞掉下来。

是换完液马上就卷了，还是过一会儿才卷的？我觉得这个细胞状态不好的时候是容易卷的，我诱导后换维持培养液时细胞卷的很厉害，原来也以为是换液造成的，后来观察了一下不是。你在仔细分析一下，一定是换液造成的马？一般帖壁细胞换液时即使是冲也只是一小部分破掉，不会大面积掉下来的，我认为。

换完液马上就卷了，细胞好象是一大片全掉下来拉，并在浮动，然后我第二天在看时就发现细胞全堆在中间，我也没在意，继续换液.但现在是我把细胞从培养箱里拿出来肉眼就能看到每个孔中间有一个小白点.我以为是污染了，拿到显微镜下看又不太像，自己感觉是细胞叠在一起长的太密了.因为能看到很致密的细胞团.而周围的细胞轮廓很清晰，但不是很多.为这个实验我已经铺了5块96孔板了，真不想再这样继续盲目下去.

我在96孔板中诱导细胞换液一般采用半量换液，这样细胞就不会被冲走了，至于换液的间隔与细胞有关，我诱导肝细胞是隔天半量换液。如果卷得特别厉害，很可能是细胞的问题，建议更新细胞株。

问：我的细胞对胰酶和ＥＤＴＡ不管用．高浓度胰酶可以，但细胞存活率不高．有没有小的细胞刮匙，（或者自制刮匙的方法），可以用于９６孔板？（我在建细胞系，非得用９６孔板）．谢谢！ 

一般情况下细胞在一次性培养瓶或培养板中贴壁较紧，都不太好消化，如果建系的话最好不用刮的方法，还是消化比较好！消化时以下几点注意了吗？

消化前用D-Hanks冲洗了吗？可以冲洗2-3遍。

适当增加胰酶浓度，提高胰酶PH值到8，减少消化时间应该对细胞影响不大。消化时放入37度培养箱。

如果细胞还是消化不下来可加适量胶原酶，有的细胞对胶原酶敏感。

市场上有买细胞刮刀，但是我用过的型号不适用与96孔。我在做96孔单克隆时一般采用酶消化法。 同意上楼的说法，消化前将细胞用D-Hanks冲洗，有助与消化，另外胰酶的最佳消化条件是 pH 8.0，37度最好. 如果效果还是不太好的话，可以采用多次消化方法。

问：D-Hanks和PBS冲洗效果有何不同？我在胰酶消化前一直用PBS冲洗。

首先，D-Hanks和PBS冲洗细胞都可以的，我两种都用过，不过严格来说我认为D-Hanks更好，因为我们的胰酶是用D-Hanks溶的，所以用D-Hanks不改变胰酶的消化环境。

第二个问题，完全可以不用wash，加入带血清的培养基之后胰酶将完全没有作用，我一般都是这样做的，但是如果EDTA浓度太高的话就需要wash了！