细胞培养板的选择和使用（四）

（一）培养板的清洗和消毒

培养板一般为一次性使用，尤其在接触了有毒、有害等物质后更应该处理后丢弃。但如果要反复使用则一定要进行正确的清洗和消毒，以保证细胞培养的效果。

问：只有紫外照射可以保证无菌吗?可不可以从清洗方面做点工作?

答：看你什么用途了，一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。

我们一般是先泡酸过夜，清洗干净，三蒸水清洗，再用无水酒精浸泡清洗，再在工作台里用无菌水过一遍，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，打开在超净工作台里近紫外（距离紫外灯<２０ｃｍ）照射半个小时以上，效果很好，没有污染过。

其实不管老板有钱没钱，我们做实验室尤其是预实验或是摸条件时，我们一般都能省就省了，留点钱还不如买点好试剂呢：）

我们一般是先清洗干净，泡酸过夜，三蒸水清洗，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，有两种选择：1、在超净台里近紫外灯（距离紫外灯<3０ｃｍ）照射半个小时以上，六孔板一般半个小时，24孔板一个小时，96孔板时间更长，效果很好，没有污染过；2、到放射科照Co60，照完了尽快用。

我们这里肿瘤细胞耐性很好，所以重复利用没什么问题，如果原代培养比较娇贵的细胞最好用新板子，也不是很贵。

我们的经验是:清洗后用消毒液浸泡，泡酸过夜，自来水反复冲洗，双蒸水冲洗三遍，无尘环境晾干，用之前紫外灯照射半小时以上，效果很好。我们现在的穷同仁一直在应用。

永久了也会变黄，因此如果做mtt或比色时是不能用的，在不熟悉细胞培养的时候可以先学学细胞记数，熟练了用新的，不过肿瘤细胞可以在旧板子上长得很好哟，原代的细胞比较难养，塑料的较好。

紫外的穿透能力很弱，板子紫外照射时是否将盖子翻过来一起照射那？还有，细胞瓶紫外效果如何？

板子泡酸后和瓶子一样的清洗方法清洗后，60度烤干，然后放在工作台里（打开盖子）用紫外线照射半小时以上，最好一小时或两小时，盖子同时反过来照。瓶子照射没有效果，要用其他方法

同意楼上大家的意见。96孔和24孔板子在做完了后要先泡清洗计，在用棉花搽洗每个孔，这样有些贴壁细胞才不会有细胞碎片的残留，在做mtt是很重要，要不很不准的。后面就是冲洗，泡酸，3蒸水洗，紫外照射30－60分钟，不要时间太长，这样板子容易变色！但是如果是做MTT还是建议用新板子！旧板子做，结果不准！

泡酸时不要用刚配好的浓酸，因为那样会把培养板表面促进细胞贴附的一层膜腐蚀掉，细胞就无法贴壁了。用酸泡完后用自来水清洗，再用蒸馏水清洗3－5次，然后泡在75％的酒精里（酒精用纯的无水乙醇），用前在紫外线下照射1h。基本可保证95％以上无菌，用这些板做做预实验是没问题的。

1.钴60照射适合大量的板同时灭菌，最好攒一箱，再送去灭菌。

2.紫外消毒适合少量的培养皿或培养板，比如培养板，将盖打开，翻过来，连同板一起在紫外下照射2小时即可，事先不用酒精泡。

(二)方法讨论

细胞培养板常用来进行不同的处理效应观察，有些检测可能直接就在培养板中进行，这里面有些什么样的经验或小窍门呢？

1．细胞培养与MTT

问:做MTT时，96孔培养板细胞浓度该是多少？

答:我觉得细胞的浓度并不需要那么精确，关键是接种于每孔的细胞数就大致处于同一水平。

比如我做MTT，起初用的细胞浓度为5000/ml，每孔100ul，培养3天观察，发现细胞数太少，各孔OD值反面难于比较。后来我换用10000/ml，结果就很好。

当然细胞数也不能太多，这其实取决于你细胞的生长速度，生长快的细胞，可接种浓度低点。这主要是使细胞增殖率不致受处理因素之外的其他因素影响，比如接触抑制，营养竞争。

总之，做MTT时细胞数应较低，目的就是为了排除其他因素的影响，以使每孔细胞生长情况尽可能地反映出处理因素的影响。

细胞接种的浓度和你的实验目的、要求、细胞种类、处理因素的特殊要求都有关系。没有简单的，每孔接种多少的一个标准。当然，可以用楼上建议的浓度开始摸索。同时，注意肿瘤细胞核正常细胞的生长数度也不一样，前者生长快，后者慢，细胞数的量也有讲究。到底多少合适，得根据你的实验具体要求来摸索。我做b16转染时，因为脂质体要求细胞融合度为30%-50%，曾经没孔接种过300-500个细胞，效果非常好，

问:我做的MTT为什么同一组的两孔差别那么大呢？做了两次都是这样！

答:产生差别的原因有多种

1.在加细胞时，细胞沉淀下来，导致两孔细胞数不同。我们通常用磁力转子对细胞缓慢搅拌，时刻保持细胞处于悬浮状态。

2.96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。

对于生长较快的细胞，例如每12小时到24小时就传代一次的细胞，应该起始浓度低一些，我一般是96孔板每孔加10 4个细胞，培养液每孔加200ul。

有些细胞生长较慢，例如72小时才传代一次，或者是原代细胞，起始浓度应高一些，我一般是96孔板每孔加2X10 4个细胞，培养液每孔加200ul。

问:96孔板培养板能否代替酶标板测吸光度？是可以拆成一条一条的那种好还是不可以拆的好？

1.最好是用酶标板，因为96孔板的各孔透光性不一致;

2.拆成一条条的方便使用一些。

MTT法计数细胞的相对数，可以对96孔板培养的细胞在用药物刺激后的直接计数；也可以把细胞制备成细胞悬液，加到96孔板中，然后加MTT孵育、计数。

所以，如果是前者，必须用培养板；如果是后者，可以用酶标板。平底的，酶标板好一些。

问：我的干预因素是乳剂（白色），对结果可能会有影响吧，如何才能减少这些干扰?

答：当然可以用，如果你害怕干扰因素对实验产生影响，那么建议你设定一空白调零孔，如100ul的培养基加上10ul的药物，测定的样品吸光度减去空白调零孔即可！

测单一时间点的OD值，直接在培养板里就是了。测不同时间点的，需要在不同的培养板里。细胞在培养板里侧就是了。干扰因素可以测前离心一下。

问：看到很多讨论说 96孔四周不做数据处理，那么还是要加细胞或培养基吗？如果我把四周设为空白孔（不加细胞）作为阴性对照，可以用来调零或计算抑制率不？

答：可用只加培养基组作为正常对照组，来计算细胞生存率=给药组MTT/正常组MTT×100%，余空可不加任何物质。　　MTT不同与做ELISA需要设立空白对照、阴性对照和阳性对照，这其中的空白对照一般用PBS，目的是去除板底效应。

实际上，对于96孔板的细胞培养可以采取一个方法来改变出现误差的情况，就是将你的分组打乱，不要让你同一组的细胞集中排在一个区域，尽量打乱，就可以了

首先，分析原因，即必须知道在96孔板四周做数据处理会有什么影响。

因为96孔板的密封性比较良好，也就是说培养箱内空气中的O2是透过板四周很小的空隙进入培养板的，细胞代谢产生的CO2也是通过四周空隙从板内排出来的。在板内外气体交换时，37度条件下，板内的水汽也被大量带出板外。这样，就会造成96孔四周孔内的体积减少，如果细心一点，就会发现外外周孔内培养基的体积明显小于内部的体积。因此，如果最外一周有细胞进行培养，则会因培养基成分的浓度偏高而对细胞有影响，同时也会因为体积变化在做加入药物干预实验时，药物浓度偏高而对测定结果有影响。

因此，在具体操作时，可以采用以下对策：

知道原因，我们可以跟据实验情况选择PBS或D－Hanks溶液，因为外周加入这种成本低廉的溶液，一方面可以减少内部各孔中细胞培养液中水份的损失，另一方面，可以做为分析染菌等突发事故的原因，进行排查，找到染菌源头。当然，因为作MTT时，你本身会做空白对照与阳性对照，所以你可以完全不用管本底带来的误差了（建议你采用中间列6个孔为空白对照组，剩下共有9组54个孔，正好可以做三个药，每个药可设高、中、低三个浓度；加细胞时，你采用随机加细胞法，反正60孔细胞你加满就可以放心去培养了！）。

2．细胞培养板与ELISA

问：请教各位，做ELISA能否用培养板呢，有什么差别呢？

答：应该用ELISA试验专用板子。细胞培养板是不行的。ELISA专用板条，是经过处理的，要求每孔的均一性要好；而细胞培养板同样经过处理，但是是为了细胞更好地贴壁生长，使用细胞培养板可能会造成孔与孔之间的显色没有可比性。

所以，细胞培养板可以做要求不严格的定性ELISA实验，而其他情况，应当使用正规ELISA板条。

问：大家的ELisa板有没有重复利用啊，我们这里重复利用，但是没有洗板机，就人工洗一下，然后煮沸，再烘干，不知这样是否合理啊，我感觉还是新板的效果好些，还请高手指教！

答：细胞培养板用于定性或要求不是很高还可以，对于定量试剂最好用酶标板，可以提高均一性减少差异，而且强吸附酶标板还可以减少包被抗原或抗体的用量，因此最好用酶标板。

ELisa板一般不能重复利用。一是对板子均匀性的要求高，重复使用难达到。二是不划算，一块板子的试剂便宜的要几百元，贵的要几千元，而一块空板贵的也就几十元，便宜的还不到10元，再将样本的价格和耗费的时间加上，而得到不靠的结果，你说应该如何办？

洗板机不是清洗重复使用板子的，而是在加样过程中为了提高自动化程度洗板子用的（洗涤是ELISA实验步骤之一）。

3．细胞培养板与免疫组化

问：在塑料的细胞培养板上，进行免疫组化应当怎样合适，有没有这样的技巧？

答：完全没有什么特别的，只是在最后封片的时候，有些不同。还有需要注意的是每一步加液体时应从培养孔的壁上轻轻加上。使液体慢慢到达孔底，我第一次作时，没注意到这一点，到最后细胞所剩无几，所以虽是细节问题，但很重要 。