细胞培养板的选择和使用

培养板的包被及相关问题：为了适应不同的实验需要，可对培养板用不同的物质进行包被后使用，这其中有促进细胞黏附的，也有用于一些特殊检测需要的。不同的实验目的可能具体的方案亦不同，根据需要灵活掌握。

(一)多聚赖氨酸包被：

问：我要培养原代神经细胞培养，要用多聚赖氨酸铺细胞培养板，请问赖氨酸液怎么配，怎样铺扳子

答：配制0.01%的多聚赖氨酸: 首先买来sigma 公司的多聚赖氨酸，如是25mg，就需要250ml三蒸水，用移液管将 少量三蒸水加到多聚赖氨酸的小塑料瓶中，然后将溶解的多聚赖氨酸加到200ml左右三蒸水中，(已置烧杯中)。最后加三蒸水达250ml，过滤除菌分装与小瓶中即可。

保存于-20度，近期用的话可放于4度冰箱内保存。 注意每一小瓶的量不要太满，若20ml的瓶子，只装15ml可，若太满，放于-2度有可能会将瓶子弄碎，因冻后体积增加。(我就有这个教训) 另外烧杯，小瓶、移液管都要灭菌处理的，泡酸高压什么的。我们用的是一种用注射器过滤的过滤器，一次性的。一个能最多有效 过滤200ml。

铺板的操作:首先要在消毒实验室，包括超净台，紫外消度20-30分钟。消毒后30分钟进入实验室。事先准备100ml三蒸水，经高压灭菌处理。具体细节就不多说了。

首先打开板子，用消毒好的试管将0.01%的多聚赖氨酸加入每一孔中，大概每孔3-4滴吧。将板子盖好放到培养箱中(37度 5%CO2)30分钟。

取出板子，用吸管将多聚赖氨酸吸出。换吸管，加入三蒸水，冲洗三次，即将每孔内加入三蒸水，没过底，多点也行。再将水吸出来。反复三次。注意换吸管，要无菌操作的。

最后将铺好的板子放于培养箱待用。

如果你做免疫组化，需要放小的玻片到孔内，就在加多聚赖氨酸之前用无菌的镊子将无菌的玻片夹到孔内即可。

问：PLL的分子量有3-5万，7-15万，15-30万几种，应怎样选择？？谢谢：）

答：我们养神经细胞，用的是分子量3万到7万的pll 。

以PBS配成1mg/ml的母液，－20度保存。使用时，用高纯度的蒸馏水稀释成0.11mg/ml的使用浓度，过滤除菌，以50微升每平方厘米的量均匀涂于培养底物的表面，室温下静置5min，吸除多余液体，股风吹干即可。

问：多聚赖氨酸包被培养板后看上去应该是什么样的？？

要做原代培养，为了促进细胞贴壁，拟用PLL包被培养板。

1.我买的是博士德分装Sigma的10ml的那种，可是院子里搜了一下，有人说没有做过细胞培养试验，不确定能否用于细胞培养！！这怎么办，不能用么？

2.我的方法是这样的，取了0。5ml，加入5毫升灭菌去离子水后，分成6份0.9ml，6孔板里放上玻片（准备以后做免疫组化直接取片子的），一个孔一份，室温5分钟后吸掉液体，超净台内吹干过夜。第二天D-Hank's液洗3遍，晾干，紫外线照一会儿再用。请问这样做有没有硬伤？？

3.包被好后的板底及玻片应该是什么样的呢？？我发现板子干了以后，上面有些白点点，一开始以为是水滴，后来发现不是。莫非是PLL，那也是不是太夸张了？？请问这种现象正常否？？

PDL有用于组化玻片包被的不能用于细胞培养，你在用前需先确定是细胞培养级的，细胞培养板用PDL包被完后是看不出什么的，如果有颗粒是PDL在配制是未完全溶解，可看一下说明书。

我包被完用无菌水洗板子2－3次，吹干后很干净，以前用PBS洗，吹干后也发现有白点，考虑是PBS中的盐沉淀。

(二)明胶包被：

问：在细胞原代培养时，在培养瓶里铺明胶，国产的明胶也以可用吗？它是用什么配置呢？还有怎么消毒明胶呢？请多指教，谢谢！

答：国产明胶不太好用，明胶可以用PBS溶液溶解，一般在100度煮15分钟，趁热分装，分装后放在4度，不要冰冻。

问：明胶消毒之后可以放置多长时间？还是现配现用呢？你说的分装是指直接铺在培养瓶吗？如果不是的话，放在4度冰箱不是已经固定了吗？固定之后有怎么铺在培养瓶呢？因为是没做过实验所以很不明白。
 
答：sigma 有现成的终浓度是2%的明胶，已消毒，买来即可使用，方便而且不贵，仅100多块钱。4度时明胶是胶冻状，室温下放置20-30分钟就可变成液态，说明书上建议使用的包被密度是5-10ug/cm2。
 
国产明胶就可以的，用去离子水配成1%即可。可以一次配50ml或100ml。使用时取你所需量高压灭菌即可。灭菌结束取出稍凉就可以铺在培养瓶中。

问：明胶包板完毕后，培养皿要干燥呢还是保持湿润？

答：明胶包被培养板或培养瓶24小时后， 将明胶倒掉，用培养基冲洗，就可以接种细胞了。

问：在园里搜索了一下关于明胶在细胞培养中的使用问题，还是有很多问题大家没有详细和标准的说明，现有几个具体问题，请教各位战友，

1.明胶溶液配置的问题:用无菌PBS配还是用去离子水配?我们实验室有国产的明胶，很大一瓶的那种，能不能用于细胞培养?难道一定要用GIBCO 20ML即用型的?

2.明胶使用浓度的问题:有说0.1%，1%和2%的，我养的是内皮细胞，应该用哪种浓度呢?

3.明胶消毒的问题:有人说可以高温高压灭菌，有人说应该要过滤。。。还有人说要先高压再乘热过滤?不会吧，到底要怎样?晕啊~~~

4.明胶包被培养瓶的问题:有人说包被后置培养箱过夜，用时在弃溶掉的，加PBS和培养液冲洗。。也有人说包被后吹干30min-60min 。再加培养液冲洗即可用，到底怎么个做法啊

5.明胶包被后的培养瓶使用期的问题:包被后的培养瓶能够用多久呢?有文献说包被7天，干2-3天后放4度保存可以在两周内使用。

答：Q1.明胶溶液配置的问题

A1: 用去離子水來配即可。國產的行不行要去試驗，保險的就是買進口的。其實通常是買Sigma的gelatin粉末來配就好了，不用買配好現成的。配好的濃縮液可分裝放-20度長期保存，即將要用的濃縮液可放4度來備用。

Q2.明胶使用浓度的问题

A2:1%是濃縮母液的濃度，使用前才取適量稀釋成0.1%來包被。

Q3.明胶消毒的问题:

A3: Gelatin是用高溫高壓殺菌的， 其他你所說的方法也不是不能用， 只是沒必要。

Q4.明胶包被培养瓶的问题

A4:通常是包被1小時就夠了，然後吸乾，不需要清洗。因為你配gelatin溶液中並沒有含其他有害的物質， 沖洗只是多了一道沒必要的工作。包被完要清洗是Collagen才需要的。

Q5.明胶包被后的培养瓶使用期的问题

A5.這個我不知道，但基本上是越快使用越好。由於包被的過程很快，所以我都是當天包被， 在等的過程中可以去做其他的事，包被即將完成的前20分鐘就開始處理細胞，等細胞收下來包被也就做好了， 馬上就用。
 
0.1%的明胶适合大多数细胞培养时的包被，在四度放置不会出现凝胶状。我参考的文献说内皮细胞用1％的明胶包被，也就是母液，它在四度放置时会适度凝结。我的内皮细胞用1％的明胶包被效果我觉得还不错。

不管你用包被1小时的方法还是包被4小时的方法，都最好从包被开始到使用的间隔不超过一天，包被的容器放置时间越长越不好。

(三)纤连蛋白（(Fibronectin， FN）包被：

因为课题需要，我要养人外周血来源内皮细胞，得先用human fibronectin包被培养板。但是昨晚我看了个通宵，把园子里关于FN包被培养板的帖子大致浏览了一遍，反而越看越糊涂了——几乎就是百家争鸣的局面：

从稀释融解开始，有人说不能用三蒸水，要用制药用的纯水，否则PH值不对会影响活力；有人说用PBS，有人说用加了尿素的PBS；母液的浓度一般说是1mg/ml，但是买来的FN一般就是1mg，按这个浓度配置母液只能得到1ml，这么小的量如何分装啊？

至于包被的浓度，差异更是很大，有人说各个公司的产品不一样，还是以说明书上说的为准，是不是这样啊？

另外，包被的方法，有4度过夜的，有37度过夜的，有37度2至3个小时的，还有四度过夜或37度2至3个小时的……

我买的是ROCHE的1mg装human fibronectin，用的是corning的24孔板，最后对各种方案进行了摸索，结果见下面的帖子。

刚刚又再看了一下浓度的问题，大致归结为以下三种方案：

1.园子里大部分战友用的还是50微克/毫升的浓度，室温或37度下放置30至40分钟。

2.我请教了有的人用的是10微克/毫升，4度过夜。

3.还有我见一篇文献《成人外周血内皮祖细胞分离和诱导分化》中南大学学报(医学版)J Cent South Univ (M ed Sci) 　2005， 30 (5)上面写的是1微克/毫升，37度过夜。

至此产生一个疑问：是不是这几种方案都可行？浓度越高的，需要的温度就越低，时间就越短，而最后达到的效果是一样的？

如果真是这样，那么以上3个方案是一个比一个便宜啊，那我干脆用第3方案得了？第1方案比第3方案贵了五十倍啊！比第2方案也贵了五倍。

非得花那么多钱吗？FN不便宜啊！

各位战友，我摸索了好几次，总共试验了以下方案：

1.50ug/ml，4度过夜；

2.10ug/ml，4度过夜；

3.50ug/ml，室温下放置45分钟至一小时；

4.10ug/ml，37度过夜；

5.1ug/ml，37度过夜。

现在养到了第四天，自我感觉贴壁效果最好的是方案4，而且该方案所用的FN还是方案2用过一次的，我把它回收了又重复利用，已经经过了一次冻融，按理说效果应该下降了不少了，但是它的贴壁时间早，细胞多而且形态比较接近长梭形，还聚集形成了很多集落样的结构，如下图：

至于溶解分装，我是用灭菌注射用水1ml将其溶解为1mg/ml，然后分装为八支EP管，负二十度保存。

我要用人纤连蛋白包被培养板养细胞，请问自己如何包被，有无其他方法可替代？

以10μg/μl的纤连蛋白(Fibronectin)于4℃包被培养板过夜，接种细胞就可以了。

我用罗氏的Fibronectin 1mg/瓶，说明书推荐：配成50ug/ml，包被用量5ug/平方厘米。室温下包被40分钟，然后吸掉多余溶液，注意培养板不能干掉，包被后立即使用，可用PBS冲洗，但没必要。具体浓度可根据实际需要调整(1～5ug/cm2)

(四)刀豆蛋白A包被：

问：我现在进行胰腺细胞培养，需要用刀豆蛋白A（Concanavalin A）包被细胞培养板。却不知如何使用。想请教各位：Con A用什麽溶液溶解、多大浓度、包被需要多长时间。

答：包被液：Buffer A 碳酸盐缓冲液（PH 9.5 0.05M），Na2CO3.10H2O 0.107g ，NaHCO3  0.073g ，二蒸H2O 25ml

包被液：10 ml+100ul2%NaN3+50ug抗原（5ug/ml）每孔100ul 。

(五)肝素化：

问：如何肝素化培养皿或细胞培养板，用于细胞与全血的共同培养 ？

答：用1250-2500 u/ml的肝素，湿润培养皿或板，然后倾去既可。

(六)病毒包被：

问：我要做间接ELISA检测抗体。要先把病毒包培养板，不知道怎么做！

答：我也没做过， 但我觉得病毒事实上也是蛋白颗粒，，在物理性质上与普通蛋白无异，因此我觉得就是一个普通蛋白的包板而已。用碳酸盐缓冲溶液。。4度过夜就行。。。，。。。

首先将病毒用包被缓冲液稀释成最佳浓度包被，四度冰箱过夜。次日用洗涤液洗涤3 次。再将一抗加入其中。最后加入酶标抗体。

最重要的一点，为防止病毒的扩散传播，一般事先都灭活才包被。

(七)anti-CD3单抗包被：

问：soluble anti-CD3单抗包被培养板时用PH9.6的碳酸盐缓冲液稀释，请问PH9.6的碳酸盐缓冲液的配方是什么。另外IL-2在培养体系中用U/ml和ng/ml，请问这如何换算。

答：包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）：精密称取碳酸钠 0.32g ，碳酸氢钠 0.586g ，加水溶解，定容至200ml。

U/m是细胞因子的活性单位，细胞因子作用于特定的靶细胞，影响靶细胞的生物活性或细胞增殖动力学，通过检测靶细胞的生物学活性或细胞增殖动力学变化，可间接反应细胞因子水平，所以生物学方法检测结果表示为相对单位或生物活性单位，一般是通过与细胞因子标准品的所测结果进行对照得出生物活性单位。而ng/ml是一个浓度单位，是通过免疫学检测方法得到的一个定量结果，检测的是细胞因子以及与细胞因子有交叉抗原的细胞因子前体等，常用ELISA法，如多克隆抗体和单克隆抗体，识别不同表位两种单抗的双抗体夹心法。由于结构和功能的不一致性，以及其它因素干扰，免疫学测定法和生物学测定法结果并不等同，所以两种单位之间也是无法换算的。必要时，可同时进行检测。