3H-TdR掺入试验
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基本原理
淋巴细胞受特异性抗原或有丝分裂原刺激后,在转化为淋巴母细胞的过程中,DNA的合成明显增加。且其转化程度与DNA的合成呈正相关,此时若将合成DNA的前体物质胸腺嘧啶核苷用放射性同位素(3 H -TdR)标记,加入到培养体系中,即被转化的淋巴细胞摄取而掺入DNA分子内。培养终止后,测定淋巴细胞内掺入的3 H -TdR的放射量,就能判断淋巴细胞的转化程度。此方法较客观、精确。
试剂及材料
1. 丝裂原:PHA、Con A、PWM或其他丝裂原。
2. 3 H -TdR(100μCi/ml)
3. 5%三氯醋酸、无水乙醇
4. 闪烁液:PPO 4g,POPOP 0.4g溶于1000ml二甲苯中。
5. 玻璃纤维滤膜及负压抽滤装置及β-计数仪;
操作方法
1. 刺激增殖反应:
①常规分离PBMC,用含20%NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至2.0×106 /ml;
②于96孔细胞培养板各孔中加入含20%NCS的RPMI-1640完全培养液100μl,然后于各孔加入上述细胞悬液100μl,于试验孔中加入丝裂原10μl(终浓度视其质量、活性而定,需预先摸索),对照孔加入生理盐水10μl;
③加盖,置37℃,5%CO2 温箱培养3d;
2. 23 H-TdR掺入及检测:
①每孔加入20μl 3 H-TdR(相当于2μCi,特异性比活性为5Ci/mmol),继续培养4h;
②用细胞收集器将细胞吸附在玻璃纤维滤纸片上,用生理盐水充分洗涤,洗除游离的3 H-TdR;滴加5%三氯醋酸1~2ml固定细胞,滴加无水乙醇脱水、脱色;
③将滤纸片烘干后,用镊子按其顺序分别依次放入盛有4ml闪烁液的塑料管内;
④β-闪烁仪自动测定样品1min,将份测定值中读数过高或过低者除去,取其平均值;
结果分析
刺激指数(stimulating index,SI)的计算:丝裂原刺激管cpm均值/生理盐水对照管cpm均值。