3H-TdR掺入试验

互联网2010-12-02

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基本原理

淋巴细胞受特异性抗原或有丝分裂原刺激后，在转化为淋巴母细胞的过程中，DNA的合成明显增加。且其转化程度与DNA的合成呈正相关，此时若将合成DNA的前体物质胸腺嘧啶核苷用放射性同位素（³ H -TdR）标记，加入到培养体系中，即被转化的淋巴细胞摄取而掺入DNA分子内。培养终止后，测定淋巴细胞内掺入的³ H -TdR的放射量，就能判断淋巴细胞的转化程度。此方法较客观、精确。

试剂及材料

1. 丝裂原:PHA、Con A、PWM或其他丝裂原。

2. ³ H -TdR（100μCi/ml）

3. 5％三氯醋酸、无水乙醇

4. 闪烁液：PPO 4g，POPOP 0.4g溶于1000ml二甲苯中。

5. 玻璃纤维滤膜及负压抽滤装置及β-计数仪；

操作方法

1. 刺激增殖反应：

①常规分离PBMC，用含20％NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至2.0×10⁶ /ml；

②于96孔细胞培养板各孔中加入含20％NCS的RPMI-1640完全培养液100μl，然后于各孔加入上述细胞悬液100μl，于试验孔中加入丝裂原10μl（终浓度视其质量、活性而定，需预先摸索），对照孔加入生理盐水10μl；

③加盖，置37℃，5％CO₂ 温箱培养3d；

2. ²³ H-TdR掺入及检测：

①每孔加入20μl ³ H-TdR（相当于2μCi，特异性比活性为5Ci/mmol），继续培养4h；

②用细胞收集器将细胞吸附在玻璃纤维滤纸片上，用生理盐水充分洗涤，洗除游离的³ H-TdR；滴加5％三氯醋酸1～2ml固定细胞，滴加无水乙醇脱水、脱色；

③将滤纸片烘干后，用镊子按其顺序分别依次放入盛有4ml闪烁液的塑料管内；

④β-闪烁仪自动测定样品1min，将份测定值中读数过高或过低者除去，取其平均值；

结果分析

刺激指数（stimulating index，SI）的计算：丝裂原刺激管cpm均值/生理盐水对照管cpm均值。