互联网2013-11-13
混合淋巴细胞培养或称混合淋巴细胞反应（MLR）是将二个无关个体的淋巴细胞混合在一起培养，由于二者的淋巴细胞膜上的组织相容性抗原不同，可互相刺激，导致对方的淋巴细胞分裂增殖和转化。转化的淋巴母细胞表现为细胞体积增大，核内DNA和胞浆内RNA合成增加等。可通过形态学方法计数转化的淋巴细胞百分数，也可通过测定激活的淋巴细胞摄取DNA合成的前体-3H标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入量的多少来判定。同位素标记法较为客观，重复性好且结果较准确。其增殖反应强度与双方组织相容性抗原的差异程度成正比。两者相容性愈差，反应愈强烈。 本法有双向和单向MLC之分，在双向MLC中，双方的淋巴细胞互相刺激而增生、转化，即双方的淋巴细胞既是刺激细胞，又是反应细胞；在单向MLC中，将一方的淋巴细胞用X线照射或用丝裂霉素C处理，使其丧失增殖反应能力而仍保留其抗原刺激效应，此时的MLC只有一方淋巴细胞发生增殖反应，故可了解不同个体淋巴细胞刺激强度与增殖反应强度。
1. RPMI 1640培养液（100mL）：内含经56℃、30min灭活的小牛血清10mL、双抗（青、链霉素）lmL，用5.6%NaHCO3 调pH至 7.2～7.4； 2. 丝裂霉索C（mitomycin C）：用双蒸水配成400μg/mL溶液； 3. 3H-TdR：用生理盐水稀释为500μg/mL，4℃存放；
4. 闪烁液、生理盐水。
1. 离心管
2. 滴管
3. 微量加样器
4. 试管架
5. 同位素微量加样器
6. 同位素测量杯
7. 49型玻璃纤维滤片
8. 超净工作台
9. 细胞培养板
10. CO2 培养箱
11. 离心机
12. 细胞收集仪
13. β液闪烁计数仪等
人外周血淋巴细胞：取两个不同个体A和B的肝素抗凝外周血，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。洗涤后用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×106 /mL。
1. 将A、B二个体的淋巴细胞悬液分别做记号，以个体A的作为MLC的反应细胞，个体B的作为MLC的刺激细胞，记作Bm； 2. 刺激细胞处理：取个体B的淋巴细胞悬液0.9mL，加人400μg/mL的丝裂霉素C 0.1mL，使其终浓度为40μg/mL细胞悬液，置37℃水浴30min，离心弃上清，沉淀细胞用培养液洗一次，调整细胞浓度至1×106 /mL； 3. 用微量加样器各取0.1mL反应细胞（A）和刺激细胞（Bm）于一圆底细胞培养板的孔中（A Bm），同时，设自身对照组AA或BBm和空白对照组。置37℃ 5%CO2 培养箱内培养5d。 4. 在培养终止前15～16h，用同位素微量加样器于每孔内加入3H-TdR 1μL（含0.5μCi）。空白对照组，此时不加同位素； 5. 样品处理：用细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用生理盐水洗去游离的3H-TdR、将滤片置60℃烘箱中烤干，冷却后将滤片放入含闪烁液的测量杯中，用β体闪烁测量仪检测放射强度。空白对照在样品处理前加入同位素，处理方法同实验组； 6. 实验结果计算：以每分钟脉冲数（counts per minute，cpm）表示。所有样品在数据处理前，均应减去空白对照组的cpm值。MLC反应强度通常以样品的cpm值或刺激指数（stimulation index，SI）表示；也可用cpm净值表示。
1. 刺激细胞与反应细胞的浓度，一般采用1:1或2:1； 2. 培养时间一般为5～6d，3H-TdR掺人时间一般为终止培养前15～16h； 3. 细胞培养板以圆底为好； 4. 实验时应注意无菌操作； 5. 本试验可用于组织器官移植配型、移植后急性排斥反应的监测指标和HLA、H-2Ⅱ类抗原的分型等研究； 6. 用两个无血缘关系个体的淋巴细胞做试验，阳性反应明显； 7. 所用器材，应按同位素操作的有关规定处理。
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