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混合淋巴细胞培养(3H-TdR掺入法)

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1985

实验原理

混合淋巴细胞培养或称混合淋巴细胞反应(MLR)是将二个无关个体的淋巴细胞混合在一起培养,由于二者的淋巴细胞膜上的组织相容性抗原不同,可互相刺激,导致对方的淋巴细胞分裂增殖和转化。转化的淋巴母细胞表现为细胞体积增大,核内DNA和胞浆内RNA合成增加等。可通过形态学方法计数转化的淋巴细胞百分数,也可通过测定激活的淋巴细胞摄取DNA合成的前体-3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入量的多少来判定。同位素标记法较为客观,重复性好且结果较准确。其增殖反应强度与双方组织相容性抗原的差异程度成正比。两者相容性愈差,反应愈强烈。
本法有双向和单向MLC之分,在双向MLC中,双方的淋巴细胞互相刺激而增生、转化,即双方的淋巴细胞既是刺激细胞,又是反应细胞;在单向MLC中,将一方的淋巴细胞用X线照射或用丝裂霉素C处理,使其丧失增殖反应能力而仍保留其抗原刺激效应,此时的MLC只有一方淋巴细胞发生增殖反应,故可了解不同个体淋巴细胞刺激强度与增殖反应强度。

实验试剂

1. RPMI 1640培养液(100mL):内含经56℃、30min灭活的小牛血清10mL、双抗(青、链霉素)lmL,用5.6%NaHCO3 调pH至 7.2~7.4;
2. 丝裂霉索C(mitomycin C):用双蒸水配成400μg/mL溶液;
3. 3H-TdR:用生理盐水稀释为500μg/mL,4℃存放;

4. 闪烁液、生理盐水。

实验设备

1. 离心管

2. 滴管

3. 微量加样器

4. 试管架

5. 同位素微量加样器

6. 同位素测量杯

7. 49型玻璃纤维滤片

8. 超净工作台

9. 细胞培养板

10. CO2 培养箱

11. 离心机

12. 细胞收集仪

13. β液闪烁计数仪等

实验材料

人外周血淋巴细胞:取两个不同个体A和B的肝素抗凝外周血,用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。洗涤后用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×106 /mL。

实验步骤

1. 将A、B二个体的淋巴细胞悬液分别做记号,以个体A的作为MLC的反应细胞,个体B的作为MLC的刺激细胞,记作Bm;
2. 刺激细胞处理:取个体B的淋巴细胞悬液0.9mL,加人400μg/mL的丝裂霉素C 0.1mL,使其终浓度为40μg/mL细胞悬液,置37℃水浴30min,离心弃上清,沉淀细胞用培养液洗一次,调整细胞浓度至1×106 /mL;
3. 用微量加样器各取0.1mL反应细胞(A)和刺激细胞(Bm)于一圆底细胞培养板的孔中(A Bm),同时,设自身对照组AA或BBm和空白对照组。置37℃ 5%CO2 培养箱内培养5d。
4. 在培养终止前15~16h,用同位素微量加样器于每孔内加入3H-TdR 1μL(含0.5μCi)。空白对照组,此时不加同位素;
5. 样品处理:用细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上,用生理盐水洗去游离的3H-TdR、将滤片置60℃烘箱中烤干,冷却后将滤片放入含闪烁液的测量杯中,用β体闪烁测量仪检测放射强度。空白对照在样品处理前加入同位素,处理方法同实验组;
6. 实验结果计算:以每分钟脉冲数(counts per minute,cpm)表示。所有样品在数据处理前,均应减去空白对照组的cpm值。MLC反应强度通常以样品的cpm值或刺激指数(stimulation index,SI)表示;也可用cpm净值表示。

注意事项

1. 刺激细胞与反应细胞的浓度,一般采用1:1或2:1;
2. 培养时间一般为5~6d,3H-TdR掺人时间一般为终止培养前15~16h;
3. 细胞培养板以圆底为好;
4. 实验时应注意无菌操作;
5. 本试验可用于组织器官移植配型、移植后急性排斥反应的监测指标和HLA、H-2Ⅱ类抗原的分型等研究;
6. 用两个无血缘关系个体的淋巴细胞做试验,阳性反应明显;
7. 所用器材,应按同位素操作的有关规定处理。

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