方案21.5 以3H-TdR 掺入测定DNA合成实验

用³H -TdR 标记细胞，提取DNA用闪烁仪测定放射活性水平

材料

无菌
处于合适时期的细胞（若使用热的 2mol/L PCA 方法需要细胞生长于玻璃器皿或试管中，若用其他方法，细胞可培养于常规的塑料皿中）

³H-TdR ，0.4 MBq /ml (约 10uC i/ml)，每毫升培养液用 lOOul

提示 某些培养基，例如 Ham’s FlO 和 F12 , 含有胸腺嘧啶脱氧核苷。它将最终决定加入的 ³H -TdR 的特异活性。因此当判断加入同位素的量时，必须要考虑到此种因素。当同位素为 40KBq/ml (约 1.0Ci/m l) 时则对于大多数培养基已足够时，对于 F10 或 F12 应当用 0.2MBq/ml(约 5uCi/ml)。

非无菌
三氯醋酸（TCA )，0.6mol/L (置冰上），每毫升培养液 6 ml
HBSS 或 D- PBSA ，冰上，每毫升培养液 2 ml
高氣酸，2mol/L 或 0.3m o l/L NaCl 含 35 mmol/L 十二烧基硫酸钠（SLS ，SDS)，每毫升培养基 0.5 ml
MeOH ，每毫升培养基 lml
液闪瓶
闪烁液（10X 高氯酸或 NaOH/SDS)

操作步骤

1. 细胞培养至所需密度（通常最高的 DNA 合成处于中对数期或者用密度限制性 DNA 合成的平台期，（见 18.5.2 节）。

2. 加人 ³H -TdR ，溶于 HBSS 的 40KBq/ml (约 1.0Ci/ml) 或 2MBq /mmol (约 50Ci/mol)。

3. 按实验需要温育细胞 1～24 h。

4. 小心地吸去放射活性培养液，置于液态放射活性废弃物的适当容器中。

5. 用 2 ml HBSS 或 PBSA 小心地洗细胞，加人 0.6mol/L 2 ml 冰上预冷的 TCA ，静置 lOmin。如果细胞松散地黏附，则用 MeOH 固定细胞（见方案 21.6)。

6. 用三氯醋酸洗细胞 2 次，每次 5 min 。

7 . 加人 0.5m1 2mol/L 高氯酸，置 60°C 热板上 30 min，然后让其冷却。或者加 0.5 ml 溶于 NaOH 中的 SLS ，然后在 37°C 温育 30 min ，或者在室温中过夜。

8 . 收集可溶性沉淀物，将其转移至闪烁液中，在闪烁仪中测定放射活性。