目标蛋白粗提方法

狭义来讲，提取指制备物与细胞固体成分或其它结合成分的分离，由固相转入液相或从细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程，即分离前期被提取物从破碎的细胞中释放出来的过程。如果被提取物程固相或与固体结合，提取时由固相转入液相，常称为固液萃取；如果被提取物已经呈液相存在，提取时由一液相转入转入另一互不相溶的液相，这种方法称为液液萃取。

广义来讲，提取又可称为抽提或萃取，贯穿在整个分离纯化过程中，如核酸制备中用氯仿或苯酚反复抽提除去蛋白质，分离DNA和RNA。

提取的好坏受到多种因素的影响，包括：

1）溶液 涉及到溶液中的保护成分、离子强度、PH值、温度、表面活性剂、变性剂（如尿素和盐酸胍）和粘稠度、溶液的更换；

2）材料 包括材料本身固有的特性、材料的选择和处理；

3）目的分子 目的分子的理化性质、存在方式和部位、含量；

4）其它因素 搅拌、提取时间的长短。

第一节 溶剂和溶解度

一.溶剂

一些常用溶剂按其极性的大小，可依顺序大体排列如下：饱和烃类

还可按形成氢键能力的大小，分为五类：

1）能形成两个以上氢键的溶剂分子 如水，其两个氢原子和一个氧原子都可以形成氢键；

2）能形成两个氢键的溶剂分子 既是氢键的供体又是氢键的受体，例如脂肪族的醇类；

3）只作质子受体的溶剂分子 如脂肪族的醚类；

4）只作质子供体的溶剂分子 如氯仿；

5）不能形成氢键的烃类 如四氯化碳。

1）和2）两类溶剂宜用于极性化合物的提取，3）和4）两类溶剂宜用于对溶液中弱极性或非极性化合物的提取。

二．溶解度

溶解度用于分离提纯有两个主要目的：1）选择一个对制备物溶解度大而对杂质溶解度小的溶剂，使制备物从组分中有选择地被孤立出来；2）或选择一个对制备物溶解度小而对杂质溶解度大的溶剂，使制备物从组分中沉淀或结晶出来。

1． 物质溶解性质的一般规律可归纳为如下几点：

1）极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性溶剂中；

2）碱性物质易溶于酸性物质中，酸性物质易溶于碱性物质中；

3）在极性溶液中，溶剂介电常数的减少伴随溶质溶解度的降低。

总之，符合"相似相溶"原则。

2． 影响物质溶解度的几个主要因素：

1）离子强度

A．有些物质，如DNA-蛋白，在高离子强度下溶解度增加。

B．另一些物质，如绝大多数球蛋白和酶，在低离子强度下溶解性增加，称为盐溶；而在高离子强度下溶解度下降，直至出现沉淀，称为盐析。

C．盐溶现象不仅在水溶液中发生，而且在低介电常数溶剂，如乙醇，也同样发生。故而稀盐液常用于大多数生化物质的提取。

2）PH 值

A．两性溶质分子，在等电点时易相互聚集，溶解度最低；而在远离等电点两侧的PH值时，溶解度增大。

B．一些酸性或碱性小分子物质，在PH值很低时酸性物质呈现非解离分子状态，而碱性物质呈现阳离子状态；反之，酸性物质呈现阴离子状态，而碱性物质呈现非解离分子状态。离子状态的物质，不论是阳离子或阴离子都易溶于水，非离子的分子状态则易溶于有机溶剂。

C．对蛋白质、酶、核酸等生物大分子来说，应避免过酸或过碱，一般控制在pH6-8范围。如单纯从溶解度考虑，等电点在酸性范围的蛋白或酶，可选用偏酸性溶液提取；等电点在碱性范围内，则选用偏酸性溶液提取，酸性条件还可解离目的蛋白与其它组分形成的离子键，并有利于细胞的溶解。

3）温度

A．温度的提高可增高物质的溶解度，减少溶液的粘度，有利于提取的进行。对于一些植物成分或某些小分子生化物质，提取温度常在50-70度。

B．热提取法虽然提高提取效率，但所得提取液含杂质较多，不如冷提取法。对绝大部分生物大分子而言，提取温度一般控制在0～10度之间，以防止生物大分子的变性。

4）去垢剂

去垢剂(表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取钟应用的较多。

A．中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如PEG200；多元醇类表面活性剂，如山梨醇、司盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白，不必先除去去垢剂。

B．阴离子去垢剂 常见的有十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠。前者可促进核蛋白的溶解，将核酸释放出来，并对核酸酶有一定抑制作用，常用于核酸的提取。

C．阳离子去垢剂 如洁尔灭、新洁尔灭、CTAB、CPC、ZEPH、克菌定、消毒净（TMPB）、杜灭芬等，消毒灭菌类居多。

D．天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂，包括种类较为广泛，如各种树胶（阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆酸类、多糖类（如环糊精）等。

E．两性表面活性剂 在碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质，起泡性好，去污力也强；在酸性溶液中则呈现阳离子表面活性剂特征，其杀菌性很强。

5)变性剂

蛋白质变性剂的作用是破坏蛋白质的次级键，如氢键、盐键和疏水力，引起天然构象的解体；它们并不破坏共价键，如肽键和二硫键，故不涉及一级结构的改变。变性剂有溶解型和沉淀型两类，SDS、尿素和胍盐是有效的溶解型变性剂，而三氯乙酸、甲醇、和氯仿/异戊醇是有效的沉淀变性剂。一般而言，变性剂应用时常大大过量，破坏氢键的变性剂用量至少两倍于氨基酸的克分子数，如1克蛋白质可可结合1.4g。SDS溶于水可达25%，对温度敏感，W/V贮存液最为方便。需要注意的是SDS的钾盐是不溶性的，所以SDS溶液中要避免混入钾盐。尿素极易溶于水，可达10mol/L,在8mol/L以上要注意温度以防止沉淀。尿素在水中缓慢分解形成氨及高度活性的氰酸离子，故要防止高温。三氯乙酸与过氯酸（TCA，PCA）都是极好的沉淀剂，能沉淀蛋白质和核酸，前者应用更为广泛。

第二节 提取方法

一．固液萃取

在固液萃取中，提取物是由固相转为液相，或由细胞内转为细胞外，其提取效率与物质的扩散作用有关。

为了增加扩散物质的量，也就是提高提取速度，常采用如下措施：

1）提高材料的破碎程度，以增加扩散面积，减少扩散距离；

2）进行搅拌，使已扩散的溶质迅速与溶剂混匀，以保持两项界面最大浓度差，或分多次提取，不断更换新鲜溶剂，以提高扩散速率；

3）延长提取时间，提高提取温度，以及减少溶液粘度（如属大分子核酸干扰，加入少量鱼精蛋白或硫酸链霉素沉淀除去）等。

实际上从破碎后的固体细胞提取所需组分，当细胞破碎程度及提取温度受到限制时，采用少量多次提取方法较为有利。

二．液液萃取

液液萃取选用的溶剂必须与被抽提的溶液互不混合、且对被抽提的溶质有选择性的溶解能力。最常用的液液萃取溶剂为二相溶剂，水或水-醇为一相，与水互不相溶的各种碳氢化合物，如低级醚、酯、苯酚等，为另外一相。

第三节 蛋白质和酶的提取分离

一．蛋白质及其溶解性质

蛋白质有多种分类方法：

1）按其功能 活性蛋白和非活性蛋白

2）按其结构 简单蛋白和结合蛋白

3）按其溶解度 水溶性蛋白、醇溶蛋白、硬蛋白（不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂，遇强酸或强碱溶解）。一般来说，大部分蛋白可溶于水、稀酸、稀碱或稀盐溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂。

二．蛋白质的一般提取方法

1． 水溶液提取

凡能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的蛋白质，一般可用稀盐或缓冲溶液进行提取，稀盐溶液和缓冲溶液，有利于稳定蛋白结构和增加蛋白质溶解度。

此时应考虑以下因素：

1）提取液体积 加入量太少则提取不完全，加的过多则不利于浓缩，一般为原材料的3-6倍的体积，可一次或分次提取。

2）盐浓度 一般在0.02-0.2M的范围内，常用的稀盐和缓冲液有0.02-0.05M磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、0.09-0.15M的氯化钠等。在某些情况下，也用到较高的盐浓度，如提取脱氧核糖蛋白及膜蛋白。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其它分子的静电结合，选用柠檬酸缓冲系统和焦磷酸缓冲液可获得较好效果。

3）pH值 一般在被提取蛋白质的等电点的两侧，碱性蛋白用稀酸提取、酸性蛋白用稀碱提取。在某些情况下，为了破坏所分离的蛋白质与其他杂质的静电结合，选择偏酸（pH3-6）或偏碱（pH10-11），可以使离子键破坏而获得单一的蛋白成分。

4）温度 提取时通常要求低温操作。只有对某些耐高温的蛋白质或酶（如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶及某些多肽激素。

5）提取时常缓慢搅拌，以提高提取效率

6）有时为了破坏蛋白质与其它物质的离子键或氢键的结合，加入少量的多价阴离子也有助于蛋白提纯。

2． 有机溶剂提取

一般和脂质结合比较牢靠或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，难溶于水、稀酸、稀盐和稀碱，常用有机溶剂提取。他们同时有亲脂性和亲水性，如丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇等。其中正丁醇应用的较为广泛，能在水和脂分子间起着类似去污剂的桥梁作用，由于丁醇与蛋白质极性基团结合的竞争力比脂质大，所以可取代蛋白质与脂质的结合位置，使原来蛋白质在水中溶解度大大增加。

有些蛋白和酶即能溶于稀酸、稀碱，又能溶于一定比例的有机溶剂。在这样的情况下，采用稀的有机溶剂提取可防止水解酶的破坏，并兼容除杂和提高提取效果的作用，现举例说明：

胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，针对组织中共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，可采用68%酒精溶液并用草酸调至pH2.5-3.0,这样便能在三方面抑制了糜蛋白酶的活性：

1）68%酒精可以使糜蛋白酶暂时失活；

2）草酸可以除去激活糜蛋白酶的金属离子钙；

3）pH2.5-3.0是糜蛋白酶不适于作用的PH值。

而以上条件对胰岛素的溶解度和稳定性并没有影响，并可以除去一部分在稀酸及稀醇中不溶解的杂蛋白

垂体前叶ACTH常采用酸性70%丙酮，其设计原理是酸性可以促使ACTH的溶解，而70%浓度丙酮对ACTH的溶解度没有影响，却大幅度地降低其他杂蛋白的溶出，对提高分离纯化的效果极为明显。

3． 从细胞膜上提取水溶性的蛋白质和酶方法：

膜上的蛋白质或酶一般有两种存在方式：一种在膜表面上，与膜成分结合较松，经过充分粉碎细胞，在一定PH范围用稀盐溶液即可提取分离；一种是膜的内在成分之一，或与膜结合十分紧密，提取十分困难，需用超声波、去污剂、或其他比较强烈的化学处理，一般常用方法有如下几种：

1）浓盐或尿素等溶液提取 如NaClO₄、尿素、盐酸胍等。当以上溶液浓度达到2M时，可抽去27%以上的膜蛋白，但这样的条件易引起蛋白质和酶的变性。

2）碱溶液提取 在pH8-11范围内，某些膜蛋白随着PH值的提高而溶解度大大增加，但碱提取法也容易引起蛋白酶和酶的失活，应用上不广。

3）加入金属螯合剂 蛋白质通过金属离子与膜成分结合时，加入金属螯合剂如EDTA可使蛋白质释放出来。

4）有机溶剂提取 使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正丁醇是抽提膜上结合或内在脂蛋白最常用也最为有效的方法。如正丁醇可在广泛的PH值（3-10）温度范围内（-2- +40）内使用。

5)去垢剂处理 用去垢剂分离膜蛋白时，要考虑两点要素，去垢剂的溶解能力和去垢剂的温和性。强阴离子去垢剂，如SDS，一般具有很好的溶解性能，但温和性不够理想，容易引起蛋白质变性；弱离子型或非离子型去垢剂对蛋白变性影响较小，但溶解能力较差。根据报道，Triton 100用于提取ADP/ATP载体蛋白时，由于作用较为温和，故所得蛋白活性要高于使用其他去污剂。去垢剂的溶解能力与溶液的离子强度有关，一般说两者呈现正比关系。

第四节 提取时的保护性措施

提取一些具有生理活性的物质时，除了考虑被提取物溶解度外，还应考虑被提取物活性的保护。对于一些生物大分子如蛋白质、酶和核酸来说，主要措施有如下几点；

1．采用缓冲系统 防止提取过程中某些酸碱基团的解离，造成溶液中PH值变化幅度过大，导致某些活性物质的变性、或由于PH变化影响提取的效果。在生化制备中，提取中常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等。

[缓冲液] 分为非-双性离子缓冲化合物类和双性离子缓冲化合物类。前者包括HMg²⁺KCl、甘氨酸-HCl、乌头酸盐-NaOH、柠檬酸盐-磷酸盐、柠檬酸盐-NAOH、醋酸盐、琥珀酸盐、顺丁烯二酸盐-NAOH、磷酸盐、TRIS-HCL、硼酸-硼砂、甘氨酸-NAOH、碳酸盐-碳酸氢盐等，存在反应性和缓冲能力有限等缺点。双性离子缓冲液虽然具有很多优点，但依然存在反应性与不适应性的问题，如HEPEs是氨基丁酸的拮抗性（反应性）、不适应于所有的组织培养（不适应性）。

2．加入保护剂 防止某些生物活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏。如最常见的巯基，是许多活性物质和酶催化的活性基团，极易被氧化，故提取时常加入一些还原剂。一些易受重金属离子抑制生理活性的物质，加入某些金属螯合剂，把有害金属离子螯和掉，而保持被提取物的活性。[螯合剂和巯基试剂] 巯基试剂在生化反应中有两个用途，一是防止蛋白质或酶等分子中的SH-基氧化成S-S，二是某些酶反应中维持体系的还原环境。经常应用的巯基试剂有二硫丁醇类化合物（如二硫苏糖醇DTT、二硫赤酰糖醇DTE）和2-巯基乙醇，谷胱甘肽也经常应用。一般来说二硫丁醇类是常选用的巯基试剂，不仅是因为挥发性低，难闻的气味较少，而且氧化电位低，比2-巯基乙醇浓度低很多的情况下，可以使其他二硫化合物完全还原。螯合剂用于控制反应中金属离子浓度或去除金属离子，常用的螯合剂有EDTA（乙二胺四乙酸）、EGTA、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸等。

3．抑制水解酶的破坏 根据不同水解酶的性质采用不同方法。如需要金属离子激活的水解酶，常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液除去溶液中的某些金属离子，使酶的活性受到抑制；对热不稳定的水解酶，可以用热提取法使之失去作用；或选用PH范围，使酶活性最低；还可针对性地加入某些抑制剂，以抑制水解酶的活性，但此类方法在蛋白提取中应用较少。

4．其它一些特殊要求的保护措施 除避免紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等情况外，有些蛋白质在提取时还有特殊要求，如固氮酶钼-铁蛋白，必须在无氧条件下进行。