DNA的粗提取与鉴定
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实验一 DNA 的粗提取与鉴定
[ 目的要求 ]
学会DNA的粗提取和鉴定的方法,观察提取出来的DNA物质。
[ 实验原理 ]
DNA在氯化钠溶液中的溶解度,是随着氯化钠的浓度变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理,可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。
DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色,因此,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
[ 实验 仪器 与设备 ]
1. 铁架台 2. 玻璃棒(1个)
3. 滤纸 4. 量筒(100ml,1个)
5. 烧杯(100ml 1个, 50ml和500ml各2个 ) 6. 试管(20ml,2个)
7. 漏斗(1个) 8. 试管夹(2个)
9. 纱布(15块) 10.离心机(1台)
[ 实验材料 ]
1. 鸡血细胞液(5ml~10ml) 2. 95%乙醇(预冷24h)
3. 蒸馏水 4. 柠檬酸钠(质量浓度 0.1g /ml)
5. 氯化钠(2mol/L和0.015mol/L) 6. 二苯胺
7. 高氯酸 8.乙醛
9. 冰乙酸
[ 实验步骤 ]
实验前需要制备鸡血溶液,制备的方法是:取柠檬酸钠的质量浓度为 0.1g /ml的溶液(抗凝剂)100ml,置于500ml烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血(约180ml)注入烧杯中,同时用玻璃棒搅拌,使血液与柠檬酸钠溶液充分混合,以免凝血。然后,将血液倒入离心管内,用1000rpm离心2min,此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时,用吸管除去离心管上部的澄清液,就可以得到鸡血细胞液(如果没有离心机,可以将烧杯中的血液置于冰箱内,静置一天,使血细胞自行沉淀)。
1. 提取鸡血细胞的细胞核物质
将制备好的鸡血细胞液5ml~10ml,注入到50ml烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20ml,同时用玻璃棒充分搅拌5min,使血细胞加速破裂。然后,用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500ml的烧杯中,取其滤液。
2 . 溶解细胞核内的 DNA
将氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液40ml加入到滤液中,并摇动烧杯,使其混合均匀,这时DNA载溶液中呈溶解状态。
3 . 析出含 DNA 的粘稠物
沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水,同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌,这时烧杯中有丝状物出现,注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水,溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水(这时溶液中氯化钠的物质的量的浓度相当于0.14mol/L)。
4 . 滤取含 DNA 的粘稠物
用放有多层纱布的漏斗,过滤步骤3中的溶液至500ml的烧杯中,含DNA的粘稠物被留在纱布上。
5 . 将 DNA 的粘稠物再溶解
取1个50ml烧杯,向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液20ml。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中,用玻璃棒不停地搅拌,使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。
6 . 过滤含有 DNA 的氯化钠溶液
取1个100ml烧杯,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液,DNA溶于滤液中。
7 . 提取含杂质较少的 DNA
在上述滤过的溶液中,加入冷却的、酒精的体积分数为95%的溶液50ml(使用冷却的酒精,对DNA的凝集效果较佳),并用玻璃棒搅拌,溶液中会出现含有杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起,并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。注意观察丝状物是什么颜色。
8 . DNA 的鉴定
取两支20ml的试管,各加入氯化钠的物质的量浓度为0.015mol/L的溶液5ml,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4ml的二苯胺 试剂 。混合均匀后,将 试管 置于沸水中加热5min,待 试管 冷却后,观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。将观察的结果填写在《实验报告册》上。
[ 作业 ]
1.步骤8的2支试管中溶液颜色的变化说明了什么?将得出的结论填写在《实验报告册》上。
2.提取鸡血中的DNA时,为什么要除去血液中的上清液?
3. 步骤1和步骤3中都需要加入 蒸馏 水,两次加入的作用相同吗?为什么?
[ 实验安排 ]
6学时