从狗的胰脏中制备粗微体

胰脏
HM 缓冲液 蔗糖-缓冲液 三乙基氨基乙酸缓冲液

1. 从动物身体切下胰脏，立即用大约 50 ml 冷 HM 缓冲液冲洗，放置于干净的纸巾上，去除结缔组织：

匀浆介质（HM）

0.25 mol/L 蔗糖-缓冲液A

缓冲液A：

50 mmol/L 三乙基氨基乙酸缓冲液（TEA），pH 7.5

50 mmol/L KOAc

6 mmol/L Mg (0Ac)₂

1 mmol/L EDTA

0.5 mmol/L PMSF

贮存液：   

1 mol/L 三乙醇氨缓冲液，pH 7.5

4 mol/L KOAc，pH 7.5

1 mol/L Mg (OAc)₂

PMSF：100 mmol/L 溶于 DMSO

2. 称量胰脏的重量，置于干净的玻璃盘里，用剃须刀片将其切成尽可能小的碎片。

3. 将切碎的胰脏过组织压碎器并在 4 倍体积的 HM 中用马达带动的 Potter-Elvehjem Teflon 匀浆器匀浆，将匀浆器的管子保持在冰水中。

4. 用 Sorvall HB-4 转头或 SS34 转头在 Sorvall 冷冻离心机（DuPont Instrumcm) (最大 1000 g）中 4℃ 3200 r/min 离心 10 分钟以去除细胞核、一些线粒体和未破碎的细胞。

5. 在同样的转头（平均 10000 g）中 4℃ 10000 r/min 离心上清（后细胞核上清）10 分钟以去除线粒体和溶酶体。

6. 用注射器和针头将上清（后线粒体上清或 PMS ) 小心转移，避免取疏松的那一层。

7. 在 Ti60 转头的离心管中铺 18 ml PMS 于 6 ml 1.3 mol/L 蔗糖-缓冲液A ( PMS 与垫层的比例大约为 3:1）上，44000 r/min ( 最大 200000 g）离心 2.5 小时。

8. 用吸管去掉上清，包栝垫层溶液、界面的膜物质和疏松层。

9. 用 Kimwipe 纸巾轻擦离心管的内壁，用 Dounce 匀浆器通过 2 到 3 次上下杵击将沉淀重悬于小体积的 0.25 mol/L 蔗糖-缓冲液 B中（1 g 组织中提取的微体约用 0.5 ml 缓冲液）。

缓冲液 B：

50 mmol/L TEA

1 mmol/L EDTA

10. 取 10 μl 与 1 ml 0.1％ SDS 溶液混合，测定 260 nm 和 280 nm 的光吸收值，用同样的缓冲液将微体的浓度调节到 50 A₂₈₀ nm/A₂₈₀ nm 的值约为 1.9。从 1 g 组织中大约获得 50 A₂₈₀ nm 单位的粗微体。

11. 分装粗微体悬浮液，在液氮中冷冻并保存在 -70℃。

12. 进一步用 EDTA 处理粗微体以增加转运活性，用凝胶过滤来减少微体在麦胚翻译系统中的抑制作用，或用核酸酶来降低本底。 EDTA 的处理是这样的：

(1) 将粗微体与等体积的 0.25 mol/L 蔗糖、50 mmol/L TEA 和 50 mmol/L EDTA 溶液混合。

(2) 将化合物 0℃ 保温 15 分钟。

(3) 在含有 0.5 mol/L 蔗糖、50 mmol/L TEA 溶液的 Ti60 离心管中铺上保温过的样品（样品与垫层的比例大约为 3：1），44000 r/min ( 最大 200000 g ) 离心 60 分钟。

(4) 用吸管或注射器取出上清，用干净的 Kimwipe 纸巾轻擦离心管内壁。

(5) 用与起始粗微体体积相等的 0.25 mol/L 蔗糖、50 mmol/L TEA 和 1 mmol/L DTT 溶液重悬沉淀，用 Dounce 匀浆器轻轻匀浆。分装悬浮液，在液氮中冷冻并保存在 -70℃。