【求助】可以使目标蛋白不表达的方法
丁香园论坛
4696
我现在在做有E-cadherin的课题,其中要涉及使E-cadherin不表达,请问除了RNAi,还有其他方法吗?谢谢
教材上没有。本人总结的文献上的方法有:
1、构建突变体 ,单点或者多点突变,使之缺失;
2、使用特异性抑制剂;
3、使用该蛋白的特异性单抗或者多抗,封闭该蛋白的作用;
4、使用与该蛋白性质相近的分子,使之与该蛋白竞争性发挥作用;
...
1、构建突变体 ,单点或者多点突变,使之缺失;
2、使用特异性抑制剂;
3、使用该蛋白的特异性单抗或者多抗,封闭该蛋白的作用;
4、使用与该蛋白性质相近的分子,使之与该蛋白竞争性发挥作用;
...
lz肯定是在动物或者细胞水平,除了干扰和抑制剂那就是用敲除了,要求高的话抑制剂可能还不行,个人认为应该是敲除>干扰>抑制剂。
路过,肤浅地讲两句:
第一 E-cadherin不表达的问题 它的在维持细胞结构稳定及其抑癌基因的作用是至关重要的,使其不表达,不知是否你的模型能构建成功;
第二 抑制剂一般来讲是抑制其功能,针对酶的抑制剂比较多,非酶的分子相对很少。E-cadherin的抑制剂似乎没听说,如果要在合成方面抑制的话,可能特异性很难做到;
第三 E-cadherin不表达最好是敲除,干扰与抑制的关系我认为抑制剂的作用应该会更强些
楼上讲“构建突变体 ,单点或者多点突变,使之缺失”我认为不正确--突变体只是使其没功能,而非不表达。
第一 E-cadherin不表达的问题 它的在维持细胞结构稳定及其抑癌基因的作用是至关重要的,使其不表达,不知是否你的模型能构建成功;
第二 抑制剂一般来讲是抑制其功能,针对酶的抑制剂比较多,非酶的分子相对很少。E-cadherin的抑制剂似乎没听说,如果要在合成方面抑制的话,可能特异性很难做到;
第三 E-cadherin不表达最好是敲除,干扰与抑制的关系我认为抑制剂的作用应该会更强些
楼上讲“构建突变体 ,单点或者多点突变,使之缺失”我认为不正确--突变体只是使其没功能,而非不表达。
最近做这个有点感触,虽然有些空泛,但是希望有用:
敲除和抑制
敲除:真正的完全不表达常规的方法比较难,一般都是构建gene targeting载体,得到小鼠模型后取其细胞做实验,这种方法一般都是完全的缺乏内源性基因的表达,目前也可以在人细胞株(HCT116)或者大鼠上做。这种方法对于一些对于细胞存活至关重要的基因有些问题,常常出现小鼠的胚胎死亡或者敲除细胞株的逐渐死亡。因此有条件性敲除(Cre小鼠)和杂合缺失等替代方法。具体方法要说的太多,你也可以查阅一下资料。
敲除后得到稳定表型的动物或者细胞,可以从整体水平观察该基因缺失后对机体各个系统功能的变化,更为全面,有可能发现更多的现象。但是这些细胞或个体从某种意义上来说属于“带病生存”,对于缺失的基因往往会出现一些代偿通路,因此研究的时候需要小心。
抑制:抑制一般来说分为转录水平抑制和转录后抑制。转录水平抑制一般方法目前还是RNAi,也就是说从基因表达上降低某种基因的水平,属于敲低(knockdown)。转录后抑制,一般是蛋白水平抑制,当然也有修饰水平的抑制,如磷酸化、去磷酸化等。常用的策略有抑制剂、特异性抗体或者封闭某些反应表位的多肽或者分子。
突变体竞争也是属于一种抑制策略,尽管不能从表达上减少内源性基因水平,但是可以利用外源性突变蛋白减低内源性蛋白的作用。
抑制一般属于短期行为,因此常常无法建立起良好的代偿旁路,而且投入相对较少,对前期研究,特别是体外细胞效应的观察更为实际。
值得提出的是,gene targeting除了敲除(Knockout,KO)之外还有Knockin,就是使该基因以突变体的形式表达,这种策略较KO稍复杂,但是有时候可以克服KO的一些缺点,更为准确。除了gene targeting之外,还有transgenic的策略,可以使RNAi在小鼠体内稳定表达或可诱导的表达,目前也是比较常用的knockdown策略。
敲除和抑制
敲除:真正的完全不表达常规的方法比较难,一般都是构建gene targeting载体,得到小鼠模型后取其细胞做实验,这种方法一般都是完全的缺乏内源性基因的表达,目前也可以在人细胞株(HCT116)或者大鼠上做。这种方法对于一些对于细胞存活至关重要的基因有些问题,常常出现小鼠的胚胎死亡或者敲除细胞株的逐渐死亡。因此有条件性敲除(Cre小鼠)和杂合缺失等替代方法。具体方法要说的太多,你也可以查阅一下资料。
敲除后得到稳定表型的动物或者细胞,可以从整体水平观察该基因缺失后对机体各个系统功能的变化,更为全面,有可能发现更多的现象。但是这些细胞或个体从某种意义上来说属于“带病生存”,对于缺失的基因往往会出现一些代偿通路,因此研究的时候需要小心。
抑制:抑制一般来说分为转录水平抑制和转录后抑制。转录水平抑制一般方法目前还是RNAi,也就是说从基因表达上降低某种基因的水平,属于敲低(knockdown)。转录后抑制,一般是蛋白水平抑制,当然也有修饰水平的抑制,如磷酸化、去磷酸化等。常用的策略有抑制剂、特异性抗体或者封闭某些反应表位的多肽或者分子。
突变体竞争也是属于一种抑制策略,尽管不能从表达上减少内源性基因水平,但是可以利用外源性突变蛋白减低内源性蛋白的作用。
抑制一般属于短期行为,因此常常无法建立起良好的代偿旁路,而且投入相对较少,对前期研究,特别是体外细胞效应的观察更为实际。
值得提出的是,gene targeting除了敲除(Knockout,KO)之外还有Knockin,就是使该基因以突变体的形式表达,这种策略较KO稍复杂,但是有时候可以克服KO的一些缺点,更为准确。除了gene targeting之外,还有transgenic的策略,可以使RNAi在小鼠体内稳定表达或可诱导的表达,目前也是比较常用的knockdown策略。
各位老师好,请问我已知道一个基因的序列,但想知道它到底受哪些上游基因的调控,请问有什么方法能解决这个问题嘛?请老师们帮帮忙,我是个菜鸟。
求教Keap1/Nrf2-ARE信号通路的抑制剂。
本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号:shixiongcoming