原理
利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性 pH 梯度中进行蛋白质的分离和分析。所以利用等电聚焦技术分析的对象只限于蛋白质和两性分子。分析的条件是凝胶中有稳定的、连续的和线性的 pH 梯度。
材料与仪器
丙烯酰胺单体贮液 过硫酸铵贮液
注射器 水浴
注射器 水浴
步骤
一、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦
1. 制胶
(1) 灌胶模具的准备
使用商品胶既方便又迅速，重复性也好，但价格昂贵，所以一般实验室均自己制胶。目前制胶有三种方法：盖板法、平移法和毛细管灌胶法。
盖板法：盖板法制胶简单，就像制作显微镜观察用的样品一样。在载玻片上倒一定量的胶，用盖玻片盖上即可。所以操作方便，但重复性很差，且不宜制作大尺寸的凝胶。模具可以在实验室自己制作。
平移法：采用原瑞典 LKB 公司的 Ultromould 模具即可进行平移法灌胶，使用此模具操作最为方便，也极易成功， 但模具价格昂贵，且凝胶的大小和厚度都受模具限制。
毛细管灌胶法：与前两种方法相比，不但模具简单，而且凝胶厚度、大小都可由自己制作的模具来控制，灌胶方法也很易掌握。作者实验室现均用自己制作的模具。毛细管灌胶模具由两个夹子和两块玻璃板组成。其中稍短的玻璃板的两侧贴有一定厚度的边。玻璃板的大小根据欲制凝胶的大小而定。
在洁净，带边的短玻璃板上倒少许疏水硅烷，用软纸或棉花在玻璃板上涂布均匀。在不带边的长玻璃板上放一块塑料支持膜，使膜紧贴玻璃。也可用 1 mm 厚的平整玻璃或用浸湿的玻璃纸替代。盖上带边的短玻璃板，在玻璃板的带边侧分别用夹子夹紧。组装好的模具水平放置，准备灌胶。
(2) 溶液配制
丙烯酰胺单体贮液：溶解 14.55 g 丙烯酰胺和 0.45 g N,N'-甲叉双丙烯酰胺在 35 ml 蒸馏水中，搅拌，直至溶解，用蒸馏水加至 50 ml。过滤，溶液可在 4℃ 保存两周。
10% (W/V) 过硫酸铵贮液：溶解 0.1 g 过硫酸铵在 1 ml 蒸馏水中，溶液必须新鲜配制。
(3) 灌胶和取胶
用带有橡皮管的注射器吸取抽滤瓶中的溶液，从模具的一端均匀缓慢地注入模具的玻璃板之间。为防止凝胶溶液洒在实验台上，也可将模具放在盘中。
凝胶聚合约需 40 分钟~1 小时。聚合后，可在模具的带边侧看到光的折射，即可取胶。将一薄刀插入底层玻璃板和塑料支持膜之间，轻轻地撬一下，底层玻璃和塑料支持膜随即分开。小心地用薄刀先沿玻璃板的边缘从玻璃板上将凝胶剥离，然后剥开带有支持膜的整张凝胶。聚合后的凝胶可立即使用，也可保存在 4℃ 冰箱中备用，但需保持一定的湿度。
2. 等电聚焦
打开循环水浴，设置冷却温度。一般为 4~15℃，视室温而定。室温低时， 采用低一些的冷却温度。反之，室温高时或系统中有尿素时，采用高一些的冷却温度。将制好的聚丙烯酰胺凝胶铺在冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免气泡陷入，以保证胶板和冷却板之间的良好接触。
用合适的电极溶液润湿滤纸电极条。不同 pH 范围的阳、阴极电极溶液可按 表 6.3 选用。在凝胶两侧分别放置阳、阴极滤纸条。有的仪器采用粗电极与凝胶直接接触的方式，则不需加滤纸电极条。
按冷却板上的格子和预先设计的实验计划将样品加在凝胶上。微量样品 ( < 3 μl ) 可直接加在凝胶上，稀样品加在加样滤纸上，等电点标准加在两侧或中间。根据等电聚焦的原理，样品可加在凝胶上任何合适的位置，浓度一般为 0.5~2 μg/μl。
将电极分别放在滤纸电极条的中心，再将阳极和阴极分别与电源的正、负极相连。接通电源。电参数参见表 6.4。注意确保电极和电极条的良好接触。电泳半小时后，去掉加样滤纸。对容易变性的样品，先进行 15~30 分钟的预聚焦，再加样。
3. pH 梯度测定
pH 梯度测定有三种方法。
(1) 早期测定 pH 梯度的方法，特别是使用圆盘电泳时，是将切成一段段的凝胶浸泡在蒸馏水中（或 10 mmol/L 氯化钾中)，然后测定浸泡液的 pH。
(2) 聚焦后，可用表面电极测 pH，按照冷却板上的格子从阴极到阳极每隔 1 cm 测一值。为防止聚焦带的扩散，测 pH 后，再重新聚焦 5~10 分钟。然后在凝胶扫描仪，摄录系统或坐标纸上画 pH 梯度。
(3) 如果使用等电点的蛋白标准，则染色后根据其电泳带的位置和等电点数据画出 pH 梯度曲线。
4. 固定、染色、脱色
电泳结束后，弃去电极条，立即将凝胶放入固定液中固定 30 分钟。弃去固定液，用脱色液浸洗凝胶 5 分钟。弃去脱色液，将凝胶放入 60℃ 的染色液中 10 分钟。弃去染色液，用脱色液洗胶，并用湿棉花轻轻地擦凝胶的表面。多次更换脱色液，直到凝胶的背景完全脱去蓝色为止。溶液配方见表 6.5。这是快速考马斯亮蓝 R-250 染色方法。根据样品性质和要求的不同，应采取不同的染色方法，“常规聚丙烯敢胺凝胶电泳” 中介绍的各种方法，甚至 “SDS聚丙嫌酷胺凝胶电泳” 中的部分方法均适用于等电聚焦电泳。但这些方法在等电聚焦电泳时，由于载体两性电解质的影响，脱色比较困难，而且灵敏度也不如常规聚丙烯酰胺凝胶电泳和 SDS 电泳，如银染法在 SDS 电泳时灵敏度可达 0.3 ng，但在等电聚焦时只能检测 1~5 ng。
5. 保存
脱色后的凝胶放在保存溶液中半小时，取出晾在玻璃板上，用一张脱色液浸湿的玻璃纸包裹凝胶板，或待凝胶发黏后，压一块透明塑料膜，晾干，这样一块带有染色蛋白带的凝胶板便可以永久保存了。
二、琼脂糖凝胶等电聚焦
琼脂糖凝胶等电聚焦具有无毒性，电泳时间短，制胶、染色、脱色、保存容易的优点，并可以分离分析分子质量达百万的化合物，在大分子质量分子的分离分析中具有独特的地位。
1. 制胶
(1) 模具的准备
用与聚丙烯酰胺凝胶毛细管灌胶法相同的模具可以灌注琼脂糖凝胶，但需使用与琼脂糖粘着好的支持膜。组装好的模具在 70℃ 烘箱中保温 15 分钟。
(2) 琼脂糖溶液的配制
将 0.15 g 无电内渗琼脂糖加在盛有 14.1 ml 蒸馏水的三角烧瓶中，在水浴上边搅拌，边加热煮沸。琼脂糖溶解后大约 10 分钟，停止加热，将水浴温度降到 75℃ 。加 0.9 ml 欲要的 pH 范围的载体两性电解质到琼脂糖溶液中混匀。从烘箱中取出模具。用一个带橡皮管的注射器吸取溶液并灌注到两块玻璃板之间。灌注时，将模具的一端抬高成一定角度，以便溶液流入，灌注后立即将模具放在水平位置。
(3) 取胶
灌胶后在室温放置至少 20 分钟。用解剖刀切去两头多余的琼脂糖胶。然后一手抓住上面的玻璃板和支持膜，另一手拿住底层的玻璃板，掰开，见图 6.15。琼脂糖凝胶固化后在冰箱中至少放 1 小时，使其充分凝固。在保持一定温度的情 况下，可在 4℃ 保存一周。使用前用滤纸轻轻地吸去凝胶表面的水。否则电泳时会短路烧胶。
2. 等电聚焦
用与聚丙烯酰胺凝胶相同的方法进行等电聚焦。电极溶液和电参数分别参见表 6.6 和 6.7。
3. pH 梯度的测定
pH 梯度的测定同聚丙烯酰胺凝胶方法，但由于没有琼脂糖凝胶等电聚焦的蛋白标准，所以通常采用表面电极测定的方法。
4. 固定、染色、脱色、保存
聚焦电泳结束后弃去电极条，立即将胶放入固定液中固定 10 分钟。弃去固定液，用 95% 乙醇洗 10 分钟。用热吹风将胶吹干。
将胶放在染色液中染 5 分钟。染色后的胶用脱色液脱色。用棉花轻轻地擦胶的表面并更换脱色液，直到胶的背景完全脱去蓝色为止。用热吹风吹干就可永久保存。
上述是常用的考马斯亮蓝 R250 琼脂糖凝胶染色方法，对不同的样品和要求可采用不同的染色方法。由于琼脂糖凝胶孔径较大，脱色比较容易，见表 6.8。
1. 制胶
(1) 灌胶模具的准备
使用商品胶既方便又迅速，重复性也好，但价格昂贵，所以一般实验室均自己制胶。目前制胶有三种方法：盖板法、平移法和毛细管灌胶法。
盖板法：盖板法制胶简单，就像制作显微镜观察用的样品一样。在载玻片上倒一定量的胶，用盖玻片盖上即可。所以操作方便，但重复性很差，且不宜制作大尺寸的凝胶。模具可以在实验室自己制作。
平移法：采用原瑞典 LKB 公司的 Ultromould 模具即可进行平移法灌胶，使用此模具操作最为方便，也极易成功， 但模具价格昂贵，且凝胶的大小和厚度都受模具限制。
毛细管灌胶法：与前两种方法相比，不但模具简单，而且凝胶厚度、大小都可由自己制作的模具来控制，灌胶方法也很易掌握。作者实验室现均用自己制作的模具。毛细管灌胶模具由两个夹子和两块玻璃板组成。其中稍短的玻璃板的两侧贴有一定厚度的边。玻璃板的大小根据欲制凝胶的大小而定。
在洁净，带边的短玻璃板上倒少许疏水硅烷，用软纸或棉花在玻璃板上涂布均匀。在不带边的长玻璃板上放一块塑料支持膜，使膜紧贴玻璃。也可用 1 mm 厚的平整玻璃或用浸湿的玻璃纸替代。盖上带边的短玻璃板，在玻璃板的带边侧分别用夹子夹紧。组装好的模具水平放置，准备灌胶。
(2) 溶液配制
丙烯酰胺单体贮液：溶解 14.55 g 丙烯酰胺和 0.45 g N,N'-甲叉双丙烯酰胺在 35 ml 蒸馏水中，搅拌，直至溶解，用蒸馏水加至 50 ml。过滤，溶液可在 4℃ 保存两周。
10% (W/V) 过硫酸铵贮液：溶解 0.1 g 过硫酸铵在 1 ml 蒸馏水中，溶液必须新鲜配制。
(3) 灌胶和取胶
用带有橡皮管的注射器吸取抽滤瓶中的溶液，从模具的一端均匀缓慢地注入模具的玻璃板之间。为防止凝胶溶液洒在实验台上，也可将模具放在盘中。
凝胶聚合约需 40 分钟~1 小时。聚合后，可在模具的带边侧看到光的折射，即可取胶。将一薄刀插入底层玻璃板和塑料支持膜之间，轻轻地撬一下，底层玻璃和塑料支持膜随即分开。小心地用薄刀先沿玻璃板的边缘从玻璃板上将凝胶剥离，然后剥开带有支持膜的整张凝胶。聚合后的凝胶可立即使用，也可保存在 4℃ 冰箱中备用，但需保持一定的湿度。
2. 等电聚焦
打开循环水浴，设置冷却温度。一般为 4~15℃，视室温而定。室温低时， 采用低一些的冷却温度。反之，室温高时或系统中有尿素时，采用高一些的冷却温度。将制好的聚丙烯酰胺凝胶铺在冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免气泡陷入，以保证胶板和冷却板之间的良好接触。
用合适的电极溶液润湿滤纸电极条。不同 pH 范围的阳、阴极电极溶液可按 表 6.3 选用。在凝胶两侧分别放置阳、阴极滤纸条。有的仪器采用粗电极与凝胶直接接触的方式，则不需加滤纸电极条。
按冷却板上的格子和预先设计的实验计划将样品加在凝胶上。微量样品 ( < 3 μl ) 可直接加在凝胶上，稀样品加在加样滤纸上，等电点标准加在两侧或中间。根据等电聚焦的原理，样品可加在凝胶上任何合适的位置，浓度一般为 0.5~2 μg/μl。
将电极分别放在滤纸电极条的中心，再将阳极和阴极分别与电源的正、负极相连。接通电源。电参数参见表 6.4。注意确保电极和电极条的良好接触。电泳半小时后，去掉加样滤纸。对容易变性的样品，先进行 15~30 分钟的预聚焦，再加样。
3. pH 梯度测定
pH 梯度测定有三种方法。
(1) 早期测定 pH 梯度的方法，特别是使用圆盘电泳时，是将切成一段段的凝胶浸泡在蒸馏水中（或 10 mmol/L 氯化钾中)，然后测定浸泡液的 pH。
(2) 聚焦后，可用表面电极测 pH，按照冷却板上的格子从阴极到阳极每隔 1 cm 测一值。为防止聚焦带的扩散，测 pH 后，再重新聚焦 5~10 分钟。然后在凝胶扫描仪，摄录系统或坐标纸上画 pH 梯度。
(3) 如果使用等电点的蛋白标准，则染色后根据其电泳带的位置和等电点数据画出 pH 梯度曲线。
4. 固定、染色、脱色
电泳结束后，弃去电极条，立即将凝胶放入固定液中固定 30 分钟。弃去固定液，用脱色液浸洗凝胶 5 分钟。弃去脱色液，将凝胶放入 60℃ 的染色液中 10 分钟。弃去染色液，用脱色液洗胶，并用湿棉花轻轻地擦凝胶的表面。多次更换脱色液，直到凝胶的背景完全脱去蓝色为止。溶液配方见表 6.5。这是快速考马斯亮蓝 R-250 染色方法。根据样品性质和要求的不同，应采取不同的染色方法，“常规聚丙烯敢胺凝胶电泳” 中介绍的各种方法，甚至 “SDS聚丙嫌酷胺凝胶电泳” 中的部分方法均适用于等电聚焦电泳。但这些方法在等电聚焦电泳时，由于载体两性电解质的影响，脱色比较困难，而且灵敏度也不如常规聚丙烯酰胺凝胶电泳和 SDS 电泳，如银染法在 SDS 电泳时灵敏度可达 0.3 ng，但在等电聚焦时只能检测 1~5 ng。
5. 保存
脱色后的凝胶放在保存溶液中半小时，取出晾在玻璃板上，用一张脱色液浸湿的玻璃纸包裹凝胶板，或待凝胶发黏后，压一块透明塑料膜，晾干，这样一块带有染色蛋白带的凝胶板便可以永久保存了。
二、琼脂糖凝胶等电聚焦
琼脂糖凝胶等电聚焦具有无毒性，电泳时间短，制胶、染色、脱色、保存容易的优点，并可以分离分析分子质量达百万的化合物，在大分子质量分子的分离分析中具有独特的地位。
1. 制胶
(1) 模具的准备
用与聚丙烯酰胺凝胶毛细管灌胶法相同的模具可以灌注琼脂糖凝胶，但需使用与琼脂糖粘着好的支持膜。组装好的模具在 70℃ 烘箱中保温 15 分钟。
(2) 琼脂糖溶液的配制
将 0.15 g 无电内渗琼脂糖加在盛有 14.1 ml 蒸馏水的三角烧瓶中，在水浴上边搅拌，边加热煮沸。琼脂糖溶解后大约 10 分钟，停止加热，将水浴温度降到 75℃ 。加 0.9 ml 欲要的 pH 范围的载体两性电解质到琼脂糖溶液中混匀。从烘箱中取出模具。用一个带橡皮管的注射器吸取溶液并灌注到两块玻璃板之间。灌注时，将模具的一端抬高成一定角度，以便溶液流入，灌注后立即将模具放在水平位置。
(3) 取胶
灌胶后在室温放置至少 20 分钟。用解剖刀切去两头多余的琼脂糖胶。然后一手抓住上面的玻璃板和支持膜，另一手拿住底层的玻璃板，掰开，见图 6.15。琼脂糖凝胶固化后在冰箱中至少放 1 小时，使其充分凝固。在保持一定温度的情 况下，可在 4℃ 保存一周。使用前用滤纸轻轻地吸去凝胶表面的水。否则电泳时会短路烧胶。
2. 等电聚焦
用与聚丙烯酰胺凝胶相同的方法进行等电聚焦。电极溶液和电参数分别参见表 6.6 和 6.7。
3. pH 梯度的测定
pH 梯度的测定同聚丙烯酰胺凝胶方法，但由于没有琼脂糖凝胶等电聚焦的蛋白标准，所以通常采用表面电极测定的方法。
4. 固定、染色、脱色、保存
聚焦电泳结束后弃去电极条，立即将胶放入固定液中固定 10 分钟。弃去固定液，用 95% 乙醇洗 10 分钟。用热吹风将胶吹干。
将胶放在染色液中染 5 分钟。染色后的胶用脱色液脱色。用棉花轻轻地擦胶的表面并更换脱色液，直到胶的背景完全脱去蓝色为止。用热吹风吹干就可永久保存。
上述是常用的考马斯亮蓝 R250 琼脂糖凝胶染色方法，对不同的样品和要求可采用不同的染色方法。由于琼脂糖凝胶孔径较大，脱色比较容易，见表 6.8。
来源：丁香实验
