流式细胞仪检测细胞凋亡率案例分析报告
上海晶莱
一、实验材料
NCI-H1299，购自上海晶莱生物技术有限公司。
表 2.1.1 主要试剂
试剂与耗材 | 厂家（货号） |
| 细胞培养瓶 | FALCON 中国（353014） |
| Penicillin/streptomycin solution | （KGY002） |
| 0.25% Tripsin-EDTA | （BK-E3076） |
| PBS | （BK330-2） |
| 胎牛血清 | GIBCO 美国（10270-106） |
| 1640 培养基 | Hyclone 美国（SH3080901） |
| Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒 |
二、实验仪器
表 2.2.1 主要仪器
| 仪器 | 厂家（型号） |
| 超净工作台 | （SW-CJ-1FD），中国 |
| CO2 培养箱 | SANYO（XD-101），日本 |
| 生物倒置显微镜 | OLYMPUS（IX51），德国 |
| 台式低速离心机 | （80-2），中国 |
| 振荡器 | （WH-2），中国 |
| 立式压力锅 | （YXQ-LS-50），中国 |
| 电热鼓风干燥箱 | （101AS-3），中国 |
| 流式细胞仪 | BD 公司，型号 C6 |
三、实验方法
细胞培养
NCI-H1299 细胞培养于含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素的 1640 培养基中，在恒温培养箱中以 5%CO2、37 ℃ 以及饱和湿度条件下松盖培养，每 2~3 d 换液一次，当细胞长至 80% 铺满时再消化传代。
实验分组
H1299 细胞-Con 组
lv-shCON 转染的 H1299 细胞
lv-shIFITM3 转染的 H1299 细胞
Annexin V-FITC/PI 检测
用去离子水将 10×Binding Buffer 稀释成 1×Binding Buffer；
细胞收集：悬浮细胞收集：离心 5 分钟；贴壁细胞：用不含 EDTA 的胰酶消化收集后（注：胰酶消化的时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与 Annexin V-FITC 的结合），在室温中，2000rpm 离心 5~10 分钟，收集细胞；
细胞洗涤：用预冷 1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm 离心 5-10 分钟，洗涤细胞；
加入 300μL 的 1×Binding Buffer 悬浮细胞；
Annexin V-FITC 标记：加入 5μL 的 Annexin V-FITC 混匀后，避光，室温孵育 15 分钟；
PI 标记：上机前 5 分钟再加入 5μL 的 PI 染色；
上机前，补加 200μL 的 1×Binding Buffer。
四、结果
五、原理
Annexin-V 可以在钙离子存在的情况下，和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合，而磷脂酰丝氨酸的外翻是细胞凋亡的早期事件。
PI 是一种 DNA 染料，当细胞凋亡的晚期，细胞的细胞膜通透性增加，PI 从而进入细胞核与 DNA 结合。
六、结果分析
Annexin-V 阴性-PI 阴性 代表正常细胞 象限： 左下，活细胞的比例
Annexin-V 阳性-PI 阴性 代表凋亡早期的细胞 象限： 右下，凋亡早期细胞的比例
Annexin-V 阳性-PI 阳性 代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞 象限：右上 晚期细胞的凋亡比例
Annexin-V 阴性-PI 阳性 一般不存在这一群细胞，如果出现这一团细胞可能是 PI 标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。 象限：左上
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