流式细胞仪检测细胞凋亡率案例分析报告

一、实验材料

NCI-H1299，购自上海晶莱生物技术有限公司。

表 2.1.1 主要试剂

试剂与耗材	厂家（货号）
细胞培养瓶	FALCON 中国（353014）
Penicillin/streptomycin solution	（KGY002）
0.25% Tripsin-EDTA	（BK-E3076）
PBS	（BK330-2）
胎牛血清	GIBCO 美国（10270-106）
1640 培养基	Hyclone 美国（SH3080901）
Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒

二、实验仪器

表 2.2.1 主要仪器

仪器	厂家（型号）
超净工作台	（SW-CJ-1FD），中国
CO2 培养箱	SANYO（XD-101），日本
生物倒置显微镜	OLYMPUS（IX51），德国
台式低速离心机	（80-2），中国
振荡器	（WH-2），中国
立式压力锅	（YXQ-LS-50），中国
电热鼓风干燥箱	（101AS-3），中国
流式细胞仪	BD 公司，型号 C6

三、实验方法

细胞培养

NCI-H1299 细胞培养于含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素的 1640 培养基中，在恒温培养箱中以 5%CO2、37 ℃ 以及饱和湿度条件下松盖培养，每 2~3 d 换液一次，当细胞长至 80% 铺满时再消化传代。

实验分组

• H1299 细胞-Con 组

• lv-shCON 转染的 H1299 细胞

• lv-shIFITM3 转染的 H1299 细胞

Annexin V-FITC/PI 检测

1. 用去离子水将 10×Binding Buffer 稀释成 1×Binding Buffer；

2. 细胞收集：悬浮细胞收集：离心 5 分钟；贴壁细胞：用不含 EDTA 的胰酶消化收集后（注：胰酶消化的时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与 Annexin V-FITC 的结合），在室温中，2000rpm 离心 5~10 分钟，收集细胞；

3. 细胞洗涤：用预冷 1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm 离心 5-10 分钟，洗涤细胞；

4. 加入 300μL 的 1×Binding Buffer 悬浮细胞；

5. Annexin V-FITC 标记：加入 5μL 的 Annexin V-FITC 混匀后，避光，室温孵育 15 分钟；

6. PI 标记：上机前 5 分钟再加入 5μL 的 PI 染色；

7. 上机前，补加 200μL 的 1×Binding Buffer。

四、结果

五、原理

Annexin-V 可以在钙离子存在的情况下，和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合，而磷脂酰丝氨酸的外翻是细胞凋亡的早期事件。

PI 是一种 DNA 染料，当细胞凋亡的晚期，细胞的细胞膜通透性增加，PI 从而进入细胞核与 DNA 结合。

六、结果分析

Annexin-V 阴性-PI 阴性 代表正常细胞 象限： 左下，活细胞的比例

Annexin-V 阳性-PI 阴性 代表凋亡早期的细胞 象限： 右下，凋亡早期细胞的比例

Annexin-V 阳性-PI 阳性 代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞 象限：右上 晚期细胞的凋亡比例

Annexin-V 阴性-PI 阳性 一般不存在这一群细胞，如果出现这一团细胞可能是 PI 标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。 象限：左上

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