入坑之前需谨慎：盘点 CAR-T 实验十大雷区

话说肿瘤医院的熊主任自从看到陈博上期的《CAR-T 实体瘤靶点英雄谱：夜空中最闪亮的星》之后，鸡血满满，奋发图强要做 CAR-T 实体瘤研究！派出得力干将汪博士！选择靶标！设计载体！体外验证！体内实验！过伦理！上临床！出任院长！迎娶白富美！走上人生巅峰！

然而，半年过去了，熊主任内牛满面抱着陈博大腿哭诉：「一入 CAR-T 深似海，从此节操是路人」「为啥我的实验不顺利？」「为啥 CAR-T 研究到处都是坑？」

陈博也很无奈：「老熊啊，你就是太顽皮，讲座听得不认真，其实很多技术难点我已经跟你讲过的，今天我再给你盘点一下吧」

【第一坑】你的 scFv 序列靠谱么？

子曰：靶标易得，抗体难筛！对于常见的靶标，scFv 序列的种类浩如烟海，熊主任一脸懵逼，不知所措。

如何在几种肿瘤靶标中取舍？

如何从鱼龙混杂的 scFv 文献数据和专利数据中沙里淘金？

如何绕开坑爹的假数据？

如何找到亲和力最高的那一类 scFv？

如果想自己筛新抗体，怎么做？

老熊，吉凯有秘籍，嘿嘿嘿……

（常见靶点数据请参考本公众号 4 月 21 日的文章：《CAR-T 实体瘤靶点英雄谱：夜空中最闪亮的星》，可在「查看历史消息」中找到）

【第二坑】你的 CAR 病毒的质量过关吗？

熊主任能力逆天，向来自己包病毒，但病毒质量和稳定性遇到了坑。

且不说支原体、细菌、真菌、病毒毒性这类基本检测必须全为阴性，内毒素<50 EU/ml也必须达标！

老熊啊，你以为这样就是合格的 CAR 病毒么？图样图森破！染了病毒的 T 细胞为啥状态不稳定？CAR-T 的动物实验为啥重复不出来？请问你的 CAR病毒经过渗滤纯化了吗？总DNA残留不能超过10 ng/ul，BSA残留不能超过30 ng/ml！怎么样？怕了吧？！

另外，现在连吉凯的屌丝版慢病毒都已经在用QPCR绝对定量测滴度了，老熊还在用不准确的活性滴度来染T 细胞么？别再拿载体空壳来糊弄T 细胞了好不好？！
说到这里，陈博已经不好意思再拿吉凯的GMP级病毒载体生产车间的照片来炫耀了，那风景大家自己想想吧~

（详细数据请参考本公众号4月8日的文章：《高大上的 CarT慢病毒是怎样炼成的》，可在「查看历史消息」中找到）

【第三坑】你以为自己真的会分离 PBMC 吗？

临床前实验的 T 细胞哪里搞？熊主任回头看了看面无血色的汪博：「小汪，来来来，再抽点儿血撒~」

老熊啊！你的博士要省着点儿用啊，咱先把PBMC的实验条件摸熟了再上吧，否则明年招不到人啦！

Ficoll离心要慢升慢降知道吧？

Ficoll对T 细胞是有一定毒性的，总量要控制哦~

Ficoll吸多了还会导致PBMC洗涤困难呦~

PMBC的抽提基本要求：纯度>90％，收获率>80％，活细胞率>95％，请善待每一个博士生！珍惜他们的血和泪！

【第四坑】同学，你的 T 细胞贴壁了吧？

在熊主任的严格管理下，汪博士常年处于亚健康状态，抽出来的 T 细胞也是萎靡不振，勉强养了三天，全贴壁了……常年研究实体瘤的熊主任和汪博士大眼瞪小眼，悬浮细胞咋就这么难养捏？

老熊啊，你以为往培养基里简单加点儿 IL-2 就万事大吉了么？其他的细胞因子表示不服！

哪种血清效果好知道不？

T 细胞的培养密度摸清楚了吗？

喂！实验操作不能再像实体瘤那么粗放了！

【第五坑】你的T 细胞感染效率为啥无法突破 50%？

老熊派汪博去血液科实验室刻苦学习了一个月 T 细胞养殖大法，汪博学成归来，果然 T 细胞养起来了，好开森！好哈皮！CAR病毒染起来！

咦？感染效率肿么只有 10%！难道是打开的方式不对吗？

「汪博，再给朕染一次！」
「启禀圣上，这次只有 8% 了……」
「小汪啊，不是我给你压力，感染效率提不起来，你每个月要多抽几次血哦，为师很担心你的健康呦~」
「熊老师…我还是处男呢，我不想死啊~~~」
「憋墨迹，快去找陈博想想办法！」

另一边，陈博一边给汪博递纸巾一边安慰：「老汪啊，你该早点儿来找我，吉凯花了两年时间开发了一套 CAR-T 感染试剂盒，绝密配方，T 细胞感染效率可达 40-80%！别哭了，快喝了这碗红糖水」

【第六坑】说老实话，你的T 细胞可以扩增多少倍？

然而熊主任还是太天真了，仅仅提高 T 细胞感染效率是远远不够的，体外扩增倍数也是关键！

如何有效激活 T 细胞？

如何在 7 天之内让 T细胞扩增 25 倍？

T细胞体外扩增的极限在哪里？

CD3+细胞的分群做了没有？

吉凯的 CAR-T 激活扩增试剂试过没有？

如何通过激活试剂控制 T细胞的形态变化？

【第七坑】你的对照组靠谱么？

对照组不是跑龙套，CAR-T 对照组更是花样繁多！

靶向能力？

杀伤能力？

激活能力？

增殖能力？

老熊，你知道该选哪种对照组吗？

对照组的CAR 框序列的突变原则是什么？

【第八坑】你的体内实验模式动物找对了吗？

熊主任！请赶紧把你的裸鼠藏起来！咱不能继续丢人了！

请使用免疫缺陷更彻底的 NSG 小鼠！这种小鼠利用 CRISPR/Cas9 系统直接在 NOD 鼠上进行 Prkdc 和 IL2rg 双基因敲除的小鼠，理论上 NSG 鼠没有任何背景残留，背景更纯。

NSG 小鼠没有成熟 T细胞、B 细胞和功能性 NK 细胞，细胞因子信号传递能力缺失，对人源 T细胞和组织几乎没有排斥反应。同时也没有 B 淋巴细胞泄漏。是目前国际公认的免疫缺陷程度最高、最适合人源细胞移植的工具小鼠。

另外，NSG 小鼠的寿命平均时间长达 1.5 年！

【第九坑】你真的搞得定 CAR-T 体内实验吗？

熊主任，你想过没有，实体瘤的动物模型怎么做？

靶细胞是不是该加个荧光素酶？

皮下成瘤？还是尾静脉肝转移？

循环系统回输 CAR-T 靠谱么？

瘤内注射还是局部注射？

什么时间检测 CAR-T 杀伤效果？

怎么检测 CAR-T的体内增殖？

长效检测需要做多久？

【第十坑】你的时间耗得起吗？

吃苦耐劳、动手能力逆天的熊主任克服了一个又一个技术坑，终于排除万难完成了肿瘤靶点 X 的CAR-T 临床前实验，拿到阳性结果的老熊却一点儿也开心不起来，三年！这个项目足足耗了三年时间！

这三年，熊主任的头顶日渐稀疏，憔悴的汪博士一再延期……最要命的是，相同靶标的CAR-T 文章已经被抢发了，隔壁科室的老王只花了一年时间抢先完成了另一种靶标的临床前实验，过了伦理，已经开展临床实验了……

在风中凌乱的老熊，默默走上天台，点燃了一颗烟……

由于篇幅有限，字字如金，陈博今天只能挑一小部分明显的坑来说说，CAR-T 基础实验部分暗流汹涌，每一个坑我们都曾经历过，痛苦过。而今满纸荒唐言，一把辛酸泪，还望各位且做且珍惜。

接到生产平台的最新线报，吉凯的大杀器「CAS9 文库药物基因筛选」项目已经正式解除封印，江湖上又将迎来一片血雨腥风，各位准备好了吗？且听下回书《前方高能慎入：药物机制研究的核武器来了》