将 siRNA 微注射入哺乳动物细胞

将 siRNA 微注射入哺乳动物细胞

材料

试剂

注射的细胞系（如在这使用的黏附细胞系）

荧光标记的葡聚糖（分子探针/In vitrogen )

我们推荐使用经氨基化学修饰后的葡聚糖，氨基使葡聚糖可以通过乙醛进行固定。同时也推荐使用分子质量在 TOkDa 左右的葡聚糖来避免其穿过核膜。

寡 聚 核 苷 酸 siR N A

利用供应商提供的网上软件可以设计目的基因的 siRNA 和 对 照 s; r n a 。将寡聚核苷酸复性后制备成 20umol/L 的储存液，一 20℃ 储 存 。

siRNA 样 品 缓 冲 液

5 mmol/L 憐 酸 納（p H 7. 2)

100 mmol/L K C l

仪器

盖 玻 片（酸洗)

分析大多数实验结果的落射荧光显微镜

配备多个物镜的高质量倒置光学显微镜

半自动的微注射系统，包括注射电压、时间以及显微操作器和操作杆都可以调控。

微注射设备可以从多个生产厂家获得，并 已 经 在 其 他 地 方 详 细 描 述（R oseet al.1999; 见Ikeda2004 的详细描述； King 2004)。微注射针可以购买得到；我们已经成功制造了我们自己的商业化注射针拆卸工具。

方法

1.制备 s i R N A 寡聚核苷酸（特异和对照的寡聚核苷酸）的工作液， s i R N A 寡聚核苷酸在 s i R N A 样品缓冲液中的浓度为 50n m o l/L 。在 s i R N A 样品缓冲液中以 5m g /m l 溶解荧光标记的葡聚糖。

2 . 制备微注射的 s i R N A ，将 s i R N A 寡聚核苷酸的工作液 1 0 倍稀释成标记的葡聚糖溶液。

该皮摩尔浓度有效，并且足以避免出现脱靶的非特异效应。

3 . 将黏附细胞铺在酸洗的盖玻片上，长至合适的密度，约 5 0 % 汇合。
在该点，如果需要使细胞静止，可以去除血清。

4 . 按标准程序，利用制备的特异或对照 s i R N A 样 品 进 行 核 的 显 微 注 射（如 见 King2004 和图 1)。

也可以使用适合研究系统的 DNA、肽以及其他活质分子（Z huetaL 2006)。

5.微注射后，将细胞孵育一段时间使靶蛋白足以敲除。
该 siRN A 效应快速并具有特异性。在多数情况下，靶 inRNA 在 注 射 后 6 h 内 用 RT-PC R 无法检测到变化。该过程的时间段随靶蛋白的半衰期而变化，但大多数调节蛋白的半衰期相对较短。

6 . 分析适用于研究系统的细胞。

该方法的一个重要方面是用于评价微注射的分析方法。 siR N A 产生的表型必须利用一个客观的指标进行标定，尤其是一个能够将毎个注射的单细胞以阳性或阴性进行划分的指标。好 的 样 品 可 以 利 用 溴 脱 氧 尿 苷 掺 人（L ie t al.2002)、适 当 标 记 物 的免疫细胞化学染色(Klappacher etal.200 2 ) 或者利用共注射的启动子/报 道 基 因 构 建 产 物（p erissie ta l.2004;Zhu et al.2006)