Nature & Cell, 揭示CAR-T开发新思路
德国赛多利斯集团
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，CAR-T疗法。目前已在血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了重大成功，但也存在严重的可能致命的副作用，例如细胞因子风暴CRS和神经毒性。同时，CAR-T疗法目前对实体瘤治疗效果非常有限，且肿瘤相关抗原在很多重要且关键的正常组织都有表达，这也增加了“On target off tumor”的毒性。
针对CAR-T疗法的局限性，研究人员采取了许多策略试图克服这些局限性，例如增强T细胞的扩增和降低T细胞的耗竭、敲除抑制基因、提高T细胞识别抗原的灵敏度。本期陈老湿给大家带来两篇CNS文章，为开发兼具安全性和有效性的CAR-T疗法提供思路。
c-Jun
提高CAR-T的有效性
2019年12月4号，斯坦福大学医学院Crystal L. Mackall教授课题组在《Nature》杂志发表的文章，揭示了CAR-T细胞中c-Jun过表达诱导T细胞耗竭抵抗[1]。研究人员构建了T细胞耗竭模型，通过ATAC-Seq技术，精确定位调节过表达或表达不足的基因组区域，找到了c-Jun基因。研究人员最终发现过表达经典AP-1因子c-Jun的CAR-T细胞具有增强扩增潜能、减少终末分化和提高抗肿瘤的效力。
过表达c-Jun的CAR-T细胞诱导T细胞的耗竭抵抗
过表达c-Jun的CAR-T细胞有效地抵抗了耗竭过程，那么是否会影响CAR-T细胞的杀伤活性呢？研究人员采用了Incucyte® 高通量实时活细胞分析系统对修饰后的CAR-T细胞进行了杀伤活性分析，将GFP+的靶细胞与CAR-T细胞接种于96孔板共培养，每2-3小时自动成像分析。Incucyte® 高通量活细胞分析系统具有无需取出细胞、无需同位素或抗体标记、免清洗、提供图像证据等优点，因此分析期间不需要进行任何的操作，实验结束后通过软件分析的Total integrated GFP intensity进行杀伤活性分析。
针对Nalm6靶细胞CAR-T以及过表达c-Jun的CAR-T细胞都表现出很好的杀伤活性，但是在低表达靶抗原的Nalm6-F靶细胞中，过表达c-Jun的CAR-T细胞表现出了更好的杀伤活性。
并且在低的效靶比的情况下，过表达c-Jun的CAR-T细胞依然可以维持更好的杀伤活性。并且在后期的小鼠体内肿瘤模型也显示了类似的结果。该文章利用在体外构建的T细胞耗竭模型，发现了c-Jun在T细胞耗竭中的作用，过表达c-Jun可以使CAR T细胞抵抗耗竭，发挥更强的肿瘤杀伤效果。
蛋白酶抑制系统
提高CAR-T的安全性
2022年4月27号，斯坦福大学医学院的Crystal L. Mackall教授课题组再次在《Cell》杂志上发表研究成果[2]，利用FDA已批准的小分子药物设计和开发了可调控的CAR系统，该系统基于可抑制蛋白酶进行的信号中和（SNIP），在基础状态下NS3p蛋白酶切割CAR分子使其失活（Off状态），SNIP CAR-T细胞暴露于NS3p抑制剂GPV，NS3p活性被抑制从而阻断其切割CAR分子，CAR分子的功能不受影响（on状态）。
SNIP工作机理
研究人员设计了不同版本的SNIP CAR-T细胞，为了快速准确地评估不同版本的CAR-T细胞的杀伤活性，研究人员同样使用了Incucyte® 检测了SNIP CAR-T针对靶细胞的杀伤活性，以及药物对SNIP CAR-T细胞的调控活性。Incucyte® 的分析结果显示SNIP系统在Off状态下没有明显的“泄露”活性，在ON状态下具有肿瘤杀伤活性且强于组成型的CAR-T细胞。
研究人员结合了RNA测序、单细胞测序、质谱流式等分析手段，发现在Off状态下的CAR-T细胞一旦被激活具有更强和更快的肿瘤杀伤动力学。并且调整给药可调整SNIP的活性为CAR-T细胞治疗打开了新的治疗窗口。多种不同的小鼠模型包括原位实体瘤模型也证实了SNIP CAR-T的有效性和安全性。
本研究基于FDA批准的小分子药物设计和开发了SNIP CAR-T平台，与传统的CAR-T平台相比具有更好的安全性和有效性。
关于免疫细胞肿瘤杀伤活性分析
免疫细胞肿瘤杀伤活性的体外评价过程涉及到免疫细胞和肿瘤细胞两种细胞共培养，因此不能采用传统的细胞增殖活性检测手段（如MTT、ATP等方法）直接进行检测。目前常用的免疫细胞杀伤研究方法包括51铬释放试验、流式细胞术、3H 胸腺嘧啶和 ATP 检测。这些方法步骤繁琐，耗费时间和人力，很难实现对效应细胞和靶细胞之间相互作用的研究。
Incucyte® 位于细胞培养箱内，可以长时程自动采集相差和荧光图片，实时观察并全自动分析肿瘤细胞杀伤和免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，配合Cell-By-Cell软件模块可以自动地完成图片的定量分析，直接测定肿瘤细胞的死亡及活力。
-参考文献-
Lynn, R.C., Weber, E.W., Sotillo, E., Gennert, D., Xu, P., Good, Z., Anbunathan, H., Lattin, J., Jones, R., Tieu, V., et al. (2019). C-Jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance. Nature 576, 293–300.
Labanieh L, Majzner RG, Klysz D, Sotillo E, Fisher CJ, Vilches-Moure JG, Pacheco KZB, Malipatlolla M, Xu P, Hui JH, Murty T, Theruvath J, Mehta N, Yamada-Hunter SA, Weber EW, Heitzeneder S, Parker KR, Satpathy AT, Chang HY, Lin MZ, Cochran JR, Mackall CL. Enhanced safety and efficacy of protease-regulated CAR-T cell receptors. Cell. 2022 Apr 20:S0092-8674(22)00391-9.
