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T 细 胞 克 隆 的 建 立

相关实验：T 细胞克隆的建立

最新修订时间：

材料与仪器

步骤

基本方案 1 产生和维持同种反应性 T h 和 CTL 克隆

尽管同种反应性 T 细胞可以从未刺激的脾细胞或淋巴结细胞中产生，但如果细胞在初次混合淋巴细胞（M L C ) 中第一次被同种抗原刺激，反应细胞的得率会更高。见以下介绍。

材 料

同种反应性小鼠脾脏 T 细胞

V H B S S (可选使用）

V D M E M -20 完全培养基

经 照 射 的（2000rad，单 元 2. 1 1 ) 同种异基因型小鼠脾脏 T 细胞

生长因子： M L C 或 Con A 刺激的细 胞 上 清（见辅助方案 1 或 2)，重组细胞因子

9 6 孔 平 底 培 养 板（Costar)

2 4 孔 细 胞 培 养 板（Linbro， Costar

1 . 在体外用同种异型抗原致敏同种反应性 T 细 胞 10〜M d (见 辅 助 方 案 2 , 步 骤 1)，最好使用 H B S S 或 D M E M 溶 液（即与小鼠血清等渗的溶液）。

2 . 准备再次刺激用的 M L C (见辅助方案 2 , 步 骤 3)，培 养 36〜48 h 。

3.将经照射（2000rad) 的同种异 型 脾 T 细 胞 ，用 D M E M -2 0 培养基调节细胞浓度为IO7 个细胞/m l ，每 孔 100ul 加 入 到 9 6 孔平底板中。

4 . 从再次刺激用的 M L C 体 系 中 收 集 T 细 胞（步 骤 2)，重 悬 于 D M E M -20 中并计数(附录 3A )。

5.将重悬的 T 细 胞 用 M L C 或 Con A (作为细胞因子）激 活 的 上 清 稀 释 到 1〜1 0 个细胞/m l ， 50ul 每孔加入步骤 3 的 9 6 孔板中， 37°C 培 养 4d。

6 . 在每孔中加入 50ul M L C 激活的上清和 5 〇 M D M E M -I O 培养基。培 养 7 〜IOd 直到在倒置显微镜下可在一些孔中观察到有明显的细胞集落形成。

7a. 用 51C r 微量释放实验检测细胞毒活性：用 51C r 微 量 释 放 实 验 检 测 细 胞 毒 活 性（Engers and Fitch; 单 元 2. 10)，区分同种反应性 C T L 和 T h 细胞。如果细胞毒活性试验显示阴性，进一步用单元 2. 1 1 所示的增殖试验检测 T h 细胞的存在。

7b. 检 测 IL-2 或 IL-4 的产生：用 抗 原（单 元 5. 1 ) 再 次 刺 激 检 测 IL-2 或 IL- 4 的产生，或用表面表达 C D 4 或 C D 8 (单 元 4. 1 和单元 4. 2 ) 筛选。

8 . 鉴定同种反应性 T 细胞克隆是否具有应有的特征（特异的细胞毒活性和特异性细胞因子的产生）。

9 . 按如下方法维持克隆的细胞：从原来的 9 6 孔板转移 IOOiUl 细 胞 悬 液（含 2. 5 X IO4〜I X lO5 个细胞）到 0. 9m l 含 6 X lO 6 个经照射的同种异型脾细胞和 0. 5 ml M L C 激活的上清的 2 4 孔细胞培养板，补 加 D M E M -20 培养基使终体积达每孔 I.5m l 。每隔一周按此种方法传代细胞。

基本方案 2 用可溶性蛋白抗原诱导 T h 克隆

不 要 臆 断 T C R 转基因小鼠是单克隆性的，因为它们会含有内源性 T C R 基因重排的细胞。

材 料

免疫用小鼠 蛋白质抗原 V D P B S 完全弗氏佐剂 x/D M E M -5完全培养基 用 0 矹 £ “ -5完 全 培 养 基 培 养 的 经 照 射 （2000^(1，单 元 2.11)的 同 基 因 型 的 脾 细胞 生长因子： M L C 或 Con A 激 活 的 上 清 （见辅助方案1 或 2 ) ; 或重组淋巴因子，如 人重组 IL-2 (hrIL- 2 ; 如 Chiron Therapeutics) 和小鼠重组 IFN-7 (mrIFN-7; 如 Genentech) 9 6 孔 平 底 板 （Costar) 2 4 孔 细 胞 培 养 板 （最 好 是 Linbro的，也 可 用 Costar) 注 ：在加入培养之前，所有的试剂和细胞都用D M E M -5完全培养基制备。 1. 抗原用Dulbecco氏 P B S 和完全弗氏佐剂溶解，在小鼠后足足垫和尾巴基底部用I : 1 抗原乳状液皮下注射小鼠，每 个 模 型 需 建 立 抗 原 剂 量 （如 IOOMgAnl〜lmg/ml) 和 反应细胞数量梯度。 2. 7d 后 ，取腋下、腹股沟和肠系膜的引流淋巴结，用 适 合 的 缓 冲 液 （单 元 2 . 1 ) 制备 单细胞悬液，最好选用与小鼠血清等渗的缓冲液（如 H B S S 、 D M E M )。 3 . 在 2 4 孔板培养体系中同时加入2 X 1 0 6 个淋巴结细胞和 6 X 1 0 6 个照射灭活的同基因 型的脾细胞，加上抗原培养6 〜8d ，补 充 D M E M -5完 全 培 养 基 至 I. 5ml。 如果需要， 加入外源性的rIL-12 (10〜2 0 U /m l)以利于T h l 型细胞的诱导，或 加 入 rIL-4 (200〜 lO O O U /m l)以利于 T h 2 型细胞的诱导。继 续 步 骤 4a〜6 a 产 生 T h l 型细胞克隆，或 步 骤 4b〜6 b 产 生 T h 2 型细胞克隆。 产生 T h l 克隆 4a. 准 备 9 6 孔 平 底 板 （也可用圆底的，但圆底的不易观察），每孔加入： 50jul用 D M E M -5完全培养基制备的经照射灭活的同基因型的脾细胞（2 X 107 个细 胞/ml) ;
50/xl用 D M E M -5完全培养基溶解的抗原2 0 0 〜1 6 0 0Mg/m l ; 2 5 4 180U/ml hrIL-2 和 25/xl 4000U/ml mrIFN-7，或 lOOjul M L C 激活的上清。 5a. 用 DMEM- 5 完全培养基重悬需要克隆的T 细胞，细胞浓度< 2 0 0 0 个细胞/ml (设 定 T 细胞数量梯度），取 50^1加入到步骤4 的 9 6 孔板中。当 使 用 M L C 激活的上清 时 （步 骤 4a) ， 用 M L C 激活的上清重悬需要克隆的T 细胞 ，每 孔 加 入 10(^1， 37°C 培 养 7d 。 6a•每孔中加入 25M 1 80U /m l hrEL-2 和 25jul 4000U /m l mrIFN-7 (或 l 〇〇/xl MLC 激活的 上清）。继续培养7d 直到阳性孔的底部（即显微镜下可观察到单细胞群簇生长）几 乎铺满细胞。 产生Th2 克隆 4b. 准 备 9 6 孔平底板，每孔中加入： 50M1用 D M E M -5完全培养基制备的经照射的同基因型的脾细胞（2 X 107 个细胞/ ml); 5 〇 4 用 D M E M -5完全培养基溶解的抗原（200〜1600Mg/ml) ; 50M 1 40U /m l hrlL-2 或 50/xl Con A 激 活 的 上 清 （4 0 % ) 〇 某 些 T h 2 型 细 胞 （Greenbaum M a Z .， 1 9 8 8 ) 的生长 需 要 IL-I。经照射的脾细 胞可以提供IL-1，但外源性的IL-I 还是必需的。外源性的rIL-4 (200〜lOOOU/ml) 或 抗 IFN-7 单 克 隆 抗 体 （R 46A 2 ， 1 : 8 杂交瘤培养上清） 同样可以促进T h 2 细胞 克隆的产生。 5b. 用 D M E M -5完全培养基重悬需要克隆T 细胞，细胞浓度< 2 0 0 0 个细胞/ml (设定 T 细胞数量梯度），取 50/^1加入到步骤4b 的 9 6 孔板中， 37°C 培 养 7d。 6b•加入50MU 0 U /m l h rIL-2或 50Ml C o n A 激 活 的 上 清 （终 浓 度 为 1 0 % ) 。继续培养 7d 直 到 阳 性 孔 底 部 （即显微镜下可观察到单细胞群簇生长）铺满细胞。 7 . 在 2 4 孔细胞培养板中加入以下试剂和细胞，调整终体积至每孔1.5m l : IOOfjJ 用 D M E M -5完全培养基制备的5 X I O 4〜2 X I O 5 个克隆细胞； 0. 9m l 用 D M E M -5完全培养基悬浮的6 X 106 个经照射的同基因型的脾细胞； 5 0 〜 40〇 jLtg/ml抗 原 ； T h l 型细胞克隆： M L C 激 活 的 上 清 （终 浓 度 3 3 % ) 或 hrIL-2 (终 浓 度 25U /ml) 和 mfIFN-7 (终浓度 250U /ml); 1112型细胞克隆：（：〇11八激活的上清（终 浓 度 10%)或 11undefined11^2(终浓度2511/1111)。 当最初从克隆板中建立维持培养体系时，最 好将整个孔转移而无需计数（用 于 T 细 胞起始克隆的IL-2浓度需高于维持培养时）。长期培养时， hrIL- 2 的终浓 度 为 10U / m l 。如有需要，采用 显 微 操 控 的 方 法 （见 辅 助 方 案 4 ) 重 新 克 隆 T 细胞以确保其克 隆形成能力。 8 . 培养细胞，用 步 骤 7 所述的方法每隔7〜IOd传代细胞。 在 进 行 T h 2 克隆传代时最好不要加生长因子。在没有抗原和Con A 激活的上清 的条件下培养4d 传代，然后与经照射灭活的同基因脾细胞静息培养10d ，实验表明 在这样条件下产生的T 细胞克隆更有利于辅助B 细 胞 抗 体 生 成 （Kimoto and Fath-

m a n ， 1982)。
9.一旦获得足够数量的细胞，通 过 检 测 IL-2、 IL-4 和 IFN-Y 的 产 生（单 元 5 . 1 ) 鉴定新产生的克隆。

生 长 因 子 来 源 的 条 件 培 养 基 的 制 备

在选择一种条件培养基之前必须考虑的一个重要因素是，每种培养基包含不同的细胞因子谱。

辅助方案 1 制备刀豆蛋白 A 活化的上清（C c m A 上清）

刀 豆 蛋 白 八 活 化 的 上 清 （0)11八上清）富含11^2，几 乎 不 含 11^4和 吓 ?^7。关于 此试剂的具体用法见基本方案2。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 新鲜制备的大鼠或小鼠的脾细胞（单 元 2.1) V D M E M -5完全培养基，不 含 M O P S 刀豆蛋白A C T L L -2 或 H T -2 小 鼠 细 胞 株 （A T C C ) 25cm2 细胞培养瓶 Sorvall离心机和 H -1000B 转 子 （或相当的） 1 . 用 D M E M -5完 全 培 养 基 （不 含 M O P S ) 以 1. 25 X I O 6 个细胞/m l 在 25cm2 细胞培养 瓶中培养大鼠或小鼠的脾细胞，加 2. 5/xg/m l 刀豆蛋白A 。 2 . 室温， 80M 离 心 lOmin，收集培养上清。 3•用C T L L -2或 H T -2小鼠细胞检测刀豆蛋白A 刺激上 清 中 IL- 2 的 含 量 （单 元 5. 1)。 一70°C 分装保存。 4 . 因 为 上 清 中 残 留 的 刀 豆 蛋 白 A 可 能 会 影 响 反 应 性 T 细 胞 克 隆 发 挥 效 应 ，可用 0. 2g/ml的葡聚糖凝胶黏合剂将之吸收去除

辅助方案 2 制备混合淋巴细胞培养上清（M L C 上清）

与刀豆蛋白A 活化上清不同，来自混合淋巴细胞反应体系的培养上清，除了含有 IL-2外 ，还含有高水平的IFN-7。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) C 57B L / 6 反 应 性小鼠脾细胞（单 元 2.1) 照 射 灭 活 的 （2000rad) D B A / 2 刺激的小鼠脾细胞 V D M E M -5完全培养基 C T L L -2或 H T -2小 鼠 细 胞 株 （A T C C ) 50m l 塑料细胞培养瓶 50m l 聚丙烯圆锥底离心管 Sorvall离心机和H -1000B 转 子 （或相当的）
1 . 在 50m l 塑料细胞培养瓶中按如下方法建立初次混合淋巴细胞反应体系：将 2. 5 X IO7 个 C 57B L / 6 反应性小鼠脾细胞与等量照射灭活的D B A / 2 刺激的小鼠脾细胞混合于 20ml D M E M -5完全培养基中，培 养 1 0 〜14d 。 2 . 收集初级混合淋巴细胞反应体系细胞至50m l 聚丙烯圆锥底离心管中，室 温 ， 200g 离 心 IOmin，弃上清，再 用 20ml D M E M 完全培养基洗1 遍 。 3 . 用与初次淋巴细胞反应体系相同的条件，制备再次淋巴细胞反应体系，将 6 X 106 个 初次淋巴细胞反应体系细胞和2. 5 X IO7 个经照射的用于刺激D B A / 2 小鼠脾细胞混 合 于 20ml D M E M -5完全培养基中， 37°C 培 养 36h 。 4 . 收集培养上清，室温， 800g 离 心 lOmin，弃细胞。 5 . 用 C T L L - 2 或 H T - 2 小 鼠 细 胞 检 测 M L C 激 活 上 清 中 IL- 2 的 含 量 （单 元 5. 1)。 一70°C 分装储存。

辅助方案 3 制备 P M A 激活的 E L -4 淋巴瘤细胞上清（E L -4 上清）

因为不需要脾细胞， P M A 激活 的 E L -4肿瘤细胞上清的制备非常方便。 E L -4上清 中 含 IL-2而 不 含 IFN-7, 一些细胞系还分泌IL-4。因此， E L -4上清可代替基本方案2 中 Con A 上清。然而，使 用 E L -4上清更利于哪种类型的T h 细胞克隆尚不清楚。 材 料 （带 项 目 见 附 录 1) E L -4 IL-2 淋 巴 瘤 细 胞 （A T C C # T I B 181) V D M E M - I O 完全培养基 P M A 活 性 炭 （可选择的） C T L L -2或 H T -2小 鼠 细 胞 系 （A T C C ) 25cm2 组织培养瓶 50m l 聚丙烯圆锥底离心管 Sorvall离 心 机 和 H - I O O O B 转 子 （或相当的） 1 . 在 25cm2 组织培养瓶中，用 含 20ng/ml P M A 的 D M E M -I O 完全培养基培养E L -4 IL- 2 淋 巴 瘤 细 胞 （IO6 个细胞/ml) 4h 。 2 . 收集细胞，室 温 ， 200g 离 心 lOmin，洗 3 遍 ，重 悬 细 胞 于 D M E M -I O 完全培养基， 37°C 培 养 36h 。或者再用活性炭吸附去除上清中所含的P M A (Farrar ， 1980)。 3 . 收集培养上清，用 C T L L -2或 H T -2小鼠细胞检测上清中IL- 2 的 含 量 （单 元 5. 1)。 一70°C 分装储存。 4 . 在制备大量上清之前应在预实验中检测细胞的反应性

辅助方案 4 用显微操作的方法克隆

与有限稀释法比较，更推荐使用重复显微操作的方法培养克隆，它是确保克隆形成能力的唯一方法。

附 加 材 料（其 他 材料 见基 本 方案 2)

微 毛 细 管（如微量血细胞比容管， BectonDickinson)
组织培养喷灯 小孔径橡胶或塑料管 6 0m m X 1 5m m 组 织 培 养 板 （Becton Dickinson Labware) la. 获 取 与 可 溶 性 抗 原 反 应 的 克 隆 ：准 备 9 6 孔 平 底 板 ，在 加 入 T 细 胞 前 ，先加入 0. 2m l 体系的适于T 细胞克隆形成所需的抗原、经照射的同基因型的脾细胞和生长 因 子 （见基本方案2 , 步 骤 4a 或 4b)。 lb. 获取同种异体反应性克隆：准 备 9 6 孔平底板，加 入 用 0.1ml D M E M -20完全培养 基悬浮 的 IO6 个经照射的脾细胞（见基本方案1 ，步 骤 3)。 2 . 将微毛细管在组织培养喷灯火焰上加热，牵拉制备合适孔径的吸管，插入一定长度 的小孔径橡胶或塑料管。 3 . 挑选一个单细胞，用橡胶或塑料吸管通过吸嘴轻轻的吸入玻璃管。将细胞转移到另 一块培养板上，加 入 D M E M -10完全培养基，反复吸吹几次，确保单细胞被转移。 4 . 转移分离的细胞至含有合适的细胞、抗 原 和 生 长 因 子 的 微 孔 中 （步 骤 1)， 37°C 培养 10 〜 1 4 d 0 5 . 检测阳性孔中细胞的相关特性，如 溶 细 胞 活 性 （单 元 2. 10)，细胞因子 的 分 泌 （单元 5.1和 单 元 5. 1 2 ) 或 增 殖 （单 元 2. 1 1 ) 。 6 . 维 持 T 细 胞 克 隆 （见基本方案1 ，步 骤 1 0 或基本方案2 , 步 骤 8)

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来源：丁香实验

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