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    人 NK T 细 胞 的 分 离 和 扩 增

    相关实验：人 NK T 细胞的分离和扩增

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    基本方案 1 NK T 细胞的鉴定

    材 料

    外周肝素抗凝血

    P B S

    R P M I -1640 培养基，含 1 0 % (V /V ) 人血清或 F C S 以 及 10U /m l I L -2 (可选）

    流 式 细 胞 缓 冲 液（flow cytometry buffer， FCbuffer) : 含 1 % (v/V ) 人 血 清 、1 % (V / V ) FBS 和 0. 1 % (m /V ) 叠氮钠的 PBS

    荧光素标记的抗 V a 24 单 抗（cloneC15B 2 ， P E 或 FITC 标 记 ， Coulter-Immunotech)

    荧光素标记的抗 V p i l 单 抗（clone C 21D 2, P E 或 F I T C 标 记 ， Coulter)

    突光素标记的同型对照抗体（BDPharmingen)

    突光素标记的抗 6B 1 1 单 抗（B D Pharmingen; 可选）

    Cy5 标记的抗 C D 4 单抗、 Cy5 标记的抗 C D 8 单 抗
    （BDPhanningen，可选）

    荧光素标记的抗 C D 161 单 抗（Coulter，推荐使用）

    荧光素标记的其他相关抗体（可选）

    含 4 % 甲醛的 PBS (P B S w ith 4 % paraformaldehyde， P F A ) : 配制时置通风橱中，加热 至 80°C ， 可搅拌以加速溶解，冷后分装，一 20°C 保存

    0.5m l 微量离心管或 9 6 孔细胞培养板

    流式细胞仪

    1 . 准备人外周肝素抗凝血（5〜10 ml) ，根据情况，室 温 可 保 存 I d 。 Ficoll-Hypaque 密
    度梯度离心法分离P B M C (单 元 8 . 1 ; 每毫升血可获得IX IO6〜2 X IO6P B M C )。分 离 的 P B M C 可用含1 0 % 人血清或F C S 及 10U/ml IL- 2 的 R P M I -1640培 养 过 夜 （或 更长些时间）。 2 . 加入15〇 11?83，室温， 300尽离心6111丨 11 ，洗 涤 ？ 8以(：两次。用 ？ (：缓冲液重悬细胞， 调整浓度为2 X 107个细胞/ml。冰 浴 15m i n 后 ， 4°C 备用。 3 . 在 0. 5m l 离心管或9 6 孔细胞培养板中加入50M1细胞悬液。 4•加入P E 标记的抗Vct2 4 单 抗 和 F I T C 标 记 抗 邪 1 1 单 抗 （各 1 网 ），至终体 积 100M1。 4°C 标 记 20〜40min，孵育期间应不时轻轻混匀细胞。对照设置包括：单独同型抗体 组 、同型抗体与抗V ( x2 4 单抗组、同型抗体与抗V p l l 单抗组。 可用标记的抗6B 1 1 单抗代替标记的抗V p l l 单抗。 5 . 可选操作：为 更 好 地 分 析 N K T 细胞 ，可 加 用 其 他 直 标 型 抗 体 （如 抗 C D 4、 C D 8、 C D 5 6 或 C D 161的抗体）或者选用生物素偶联的一抗与Cy5 或 A P C 标记的链亲和素 间标系统。后者应另外设链亲和素二抗对照组。 6 . 用 F C 缓冲液洗涤细胞1 次 ，加 入 0.5ml F C 缓冲液重悬细胞。 7 . 标记好的样品应在数小时内用流式细胞仪检测（推荐使用），细胞经固定后，可保存 更长时间。细胞固定方法如下：用冰预冷的P B S 洗 涤 细 胞 2 次 后 ，加 入 0.3m l 冰预 冷 的 ？ 8 8 ，用 枪头轻轻吹打混匀细胞，再 加 入 0.111114%??八 的 ？ 8 3 ，冰上固定 5min，并不时轻摇混匀细胞。最后将固定好的细胞洗涤1 次 ，重 悬 于 F C 缓冲液中， 置 4°C 待检。 8 . 以淋巴细胞设门，分 析 IO5个以上的淋巴细胞，比较不同样品间N K T 细胞的差异 (流式分析见单元4)。 用前散射角和侧散射角作点图，对活细胞设门。死亡细胞也可用P I 染色，然后 对 P I 拒染的活细胞设门，从而剔除死细胞背景。此时，实验步骤几乎同前，唯一不 同的是，由于P I 荧光与P E 的检测通道重叠，因此应使用其他荧光素标记的抗体代 替 P E 标记的抗体。例如，用生物素偶联的抗Vct2 4 单 抗 代 替 P E 标 记 的 抗 V a 2 4 单 抗 ，检测时相应的改用Cy5 或 A P C 标记的链亲和素二抗。需指出的是，此时应设置 一组只加Cy5 或 A P C 标记的链亲和素二抗的对照组。细胞经过标记和洗涤后（步骤 6)，加 入 50/xg/m l P I ，并 立 刻 用 流 式 细 胞 仪 进 行 检 测 ，而 且 P I 染色的细胞不能 固定。

    基 本 方 案 2 免 疫 磁 珠 法分 离 NK T 细胞及后续扩增

    本法可从几毫升的外周血中分离和扩增 N K T 细 胞（< 1 0 000 N K T 细胞），浓缩白 细 胞（分离血小板时的副产品）也可作为 N K T 细胞的来源。

    材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)

    外周肝素抗凝血

    P B S ，含 2m m o l / L E D T A (附录 1)

    未标记的抗 V 〇 t 2 4 单 抗（Coulter)

    未标记的抗 6B 1 1 单 抗 ，即 抗 TCRot 单 抗（B D Pharmingen)
    羊抗小鼠 IgG 磁 珠 （Miltenyi Biotec) 结合缓冲液：含 2mmol/L E D T A 和 2 % (V /V ) 人血清的PBS V T 细胞培养基 含 9 0 % (V A 0 FBS/10% (V7 V ) 的 二 甲 基 亚 砜 （dimethyl sulfoxide， D M S 0) a-GalCer (a-galactosyl ceramide? Kirin Brewery) A I L -2 M S 或 L S 分 离 柱 （起始细胞量分别低于IO8个 或 IO9个 ； Miltenyi Biotec) 磁 铁 架 （miniMACS 或 m i d i M A C S ， Miltenyi Biotec) 7 辐照源 9 6 孔圆底细胞培养板或9 6 孔平底细胞培养板 1•取50〜I O O m l 外周肝素抗凝血， Ficoll-Hypaque密 度 梯 度 离 心 法 分 离 P B M C (单元 8. 1 ; 可 获 得 >108个细胞）。 2•加入15m l P B S /E D T A ，室温， 300g 离 心 6min，洗涤细胞2 次 。用结合缓冲液重悬 细胞，调整浓度为 IO8个细胞/m l ，冰 浴 15min。 3•加入未标记的抗V 〇： 2 4 单抗或未标记的抗6B 1 1 单 抗 （每 IO8个细胞加入10Mg) ，终浓 度 约 为 10jug/m l ，冰 浴 20〜30min。 4 . 加 入 PB S /E D T A ， 4°C ， 700g 离 心 30s，洗涤 细 胞 2 次 。将 IO8个细胞重悬于0. 8ml 结合缓冲液中。加 入 〇 .2m l 羊 抗 小 鼠 I g G 磁珠 ，冰 浴 20〜30min，期间时应不时混 匀细胞。 5 . 将 M S 或 L S 分离柱安装在磁铁架上，用 3m l 结合缓冲液预洗涤分离柱。在磁珠标记 的细胞悬液中加入适量PB S /E D T A ，室温， 700g 离 心 30s，洗 涤 细 胞 2 次 。用 Iml 结 合 缓 冲 液 （室温）重悬磁珠标记的细胞，然后将细胞悬液加入分离柱中。 6 . 用 P B S /E D T A 洗涤分离柱3 次 ，每 次 3m l ，收 集 流 穿 液 （含未被磁珠结合的细胞）。 从中取出约IO7个细胞，经照射灭活后用作饲养细胞。 7 . 从磁铁架上取下分离柱，加 入 3m l P B S /E D T A ，将磁珠结合的细胞洗脱下来。如果 预实验显示阳性细胞不能达到预期纯度，可将洗脱的阳性细胞再次过柱分离。 8•加入10ml T 细胞培养基，室温， 300g 离 心 6min，将阳性细胞洗涤1 次。用 0.1ml T 细胞培养基重悬细胞并计数。 用 流 式 细 胞 仪 分 析 阳 性 细 胞 ， 测 定 磁 珠 分 离 效 果 （如 果 后 续 实 验 中 未 扩 增 出 N K T 细 胞 ， 流 式 分 析 则 尤 为 重 要 ）。 考 虑 到 N K T 细 胞 的 含 量 较 低 ， 可 加 大 P B M C 的 起 始 用 量 。 9• 照 射 灭 活 （3000〜5000m d ) 未结合磁珠的P B M C (步 骤 6)，用作饲养细胞。如计划 进行第二轮刺激，将 饲 养 细 胞 悬 液 （照射前或照射后）每 支 1.0m l ，用 9 0 % FB S / 1 0 % D M S O 冻 存 液 冻 存 备 用 （置冻存盒内一80°C 过夜后，转入液氮中长期冻存）。使 用预先冻存的P B M C 作为饲养细胞时，如果台盼蓝拒染法（附 录 3A ) 检测细胞活率 小 于 4 0 % ，应将细胞充分洗涤后，用 Ficoll-Hypaque密度梯度离心法重新分离P B - M C 0 10.在 9 6 孔板中加入等量的照射灭活后自体P B M C 和分离的N K T 细 胞 （9 6 孔圆底板 每孔最多加入IO4个 细 胞 ， 9 6 孔平底板每孔最多加入IO5个细胞），然 后 加 入 20ng
    a-GalCer，用丁细胞培养基补足至200^1。培 养 板 置 37°C ， 1 0 % C 〇 2 (10%(：〇 2用 于细胞密度较低时）细胞培养箱中培养1〜2d 。 11. 1〜2d 后 加 入 lOOU/m l 人 IL- 2 , 继 续 培 养 （不更换培养基） 2 周 左 右 （其间会观察 到许多母细胞集落，母细胞圆形，体积较大）。 12•轻轻吸弃约15〇 W 培养基，补 充 含 IL- 2 的 新 鲜 T 细胞培养基。每 隔 2〜3d 重复换 液 ，直至母细胞布满整个孔底。将 细 胞 1 : 2 传代至新的9 6 孔板中；细胞生长过快 时，可 将 9 6 孔平底板孔中的细胞传到2 4 孔板中。根据细胞增殖情况，继续传代培 养 （大约几周）。 1 3 . 当细胞增殖变缓或停止时，可用 饲 养 细 胞 或 丝 裂 原 进 行 二 次 刺 激 （见辅助方案）。 如用此静息细胞进行功能实验，则将细胞转入低浓度IL-2 (lOU/ml) 的 T 细胞培 养基中。为防止细胞死亡，应用一周左右时间逐步将IL-2浓 度 从 50〜lOOU/m l 降 至20〜l〇U /m l 。 1 4 . 用流式细胞仪检测扩增培养的NK T 细胞的纯度，一般情况下，外周血来源的NK T 细胞扩增后纯度应大于9 0 % 。 1 5 . 参 照细胞冻存法，将 NK T 细胞冻存。冻存时应选用活化状态而非静息状态的NK T 细胞，冻存液为 9 0 % FCS/ 1 0 % DMSO, 每支冻存I X l O 5〜2 X 105个细胞

    备 选 方 案 I N K T 细胞的流式分选及扩增

    附 加 材 料

    F A C S 缓冲液：含 1 % CV7 V ) 人血清及1 % ( V A O F B S 的 PBS 高速 F A C S 分 选 仪 （MoFlo， Cytomation) 1•取50〜IOOml外周抗凝血， Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离^ lO8 P B M C (单元 8.1)。取出部分细胞，经照射灭活后用作饲养细胞。 2 . 在剩余细胞中加入15m l F A C S 缓冲液， 25°C ， 300g 离 心 6min，洗 涤 2 次 。然后用 F A C S 缓冲液重悬细胞，调整浓度至IO7〜IO8个细胞/m l ，冰 浴 15min。 3 . 取 0.1m l细胞悬液，加 入 I iUg F IT C 标记的同型对照抗体作为对照组。剩余细胞加入 F IT C 标记的抗Va2 4 单抗，终 浓 度 l〇Mg/m l 。冰 浴 30min。 4 . 流式分析并选定Vcx24+ 细 胞 群 （含量< 1 % ) , 用 高 速 F A C S 仪进行分选。为提髙细 胞活力，应直接将分选的细胞放入含T 细胞培养基的试管中。 可 选 操 作 ：取 部 分 细 胞 用 抗 Vct2 4 和 抗 V pll ( 或 6B1 1 ) 双 标 精 确 选 定 N K T 细 胞 群 。 以 便 F A C S 分 选 时 利 用 这 些 参 数 对 单 色 标 记 的 NK T 设 门 。 5 . 用 T 细胞培养基将分选的细胞洗涤1 次 （见基本方案2 ) ， 加入照射灭活的自体PBM C 共培养，然 后 用 cx-GalCer选择性扩增。

    备 选 方 案 2 NK T 细胞的克隆

    附 加 材 料（其 他 材料见基本方案 1 和 2) 1

    T 细胞克隆培养基： R P M I -1640，含 1 0 % (W V ) 自体人血清、 20U /m l I L -2 及20U/ml IL-7植物血凝素 (phytohemagglutinin-P ， P H A -P ; Difco)

    1.Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离 T O M C (单 元 8.1)。取出部分细胞，照射灭活后用作饲养细胞。

    2 . 剩余细胞用 P B S 洗涤一遍，加 入 含 1 0 % 人血清的 P B S 重悬细胞，调 整 浓 度 为 IO8个细胞/m l ，冰 浴 15 min。

    3 . 加入荧光素标记的抗 V a 2 4 单抗和另一种荧光素标记的抗 V p i l 单 抗（或标记的抗6B 11 单抗，推荐使用），终浓度均为 IOiU g A n U 冰 浴 30 min。同时，取部分细胞加入相应的同型对照抗体。

    4 . 在 9 6 孔 圆 底 培 养 板 中 加 入 IO5 照 射 灭 活 后（5000rad) 的 自 体 饲 养 细 胞 和 P H A - P(终 浓 度 2ug/ml) ，补 充 T 细胞克隆培养基至终体积 0.1m l 。同时用流式分选仪分选V a24+ Vpll+ (或 6B 1 1 + ) 双阳性细胞，分选出的细胞应直接加入上述 9 6 孔板中。

    5.—周后，每孔加入 0.1 ml T 细 胞 克 隆 培 养 基（不 含 P H A -P )。显微镜下观察细胞生长情况： 10〜M d 后 ，阳性孔中会出现一个或多个母细胞克隆（母细胞 圆 形 ，体积较大，每个克隆细胞数超过 100 个）。

    6 . 根据克隆生长情况，每 隔 2〜3d 用 T 细胞克隆培养基传代。如果用自体血清进行 T克隆，当细胞扩增后，每次传代时培养基中增加 2 5 % 的异体人血清或 F B S ，直至完全取代自体血清。

    7 . 当细胞数量足够时，用流式细胞仪检测不同克隆的 V a 2 4 和 Vpll ( 或 6B 1 1 ) 表达情况。

    3 〜4 周 后 ，细 胞 可 进 行 二 次 刺 激 ，或 者 在 T 细 胞 克 隆 培 养 基 中 继 续 培 养 几 周 。

    辅 助 方 案 NK T 细胞的二次刺激和克隆

    材 料

    外周肝素抗凝血或浓缩白细胞 V P B S B 细 胞 株 （J Y 或 C 1R ) V 扩增培养基 小鼠抗人 C D 3 单抗，如 U C H T l (IgGl， Ancel) 或 O K T 3 25cm2细胞培养瓶 1. Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离P B M C (单 元 8.1)。用 P B S 洗 涤 P B M C 细胞， 由于 Ficoll对 A P C 及 N K T 细胞克隆有毒性，因此应至少洗涤3 次 。取 部 分 P B M C 细胞，经 5000rad照射灭活后作为饲养细胞，同时制备照射灭活后的人B 细 胞 （JY 或 C 1R ) 作为饲养细胞。 2 . 取静息期T 细 胞 （距离最后一次抗原或丝裂原刺激大约2 周时间）进行刺激。注意 起始时培养基应不含IL-2 (否则会导致细胞凋亡）。 3 . 第 0 天 ，在 25cm2细胞培养瓶中加入5X 104〜IOXlO4个 T 细胞、 2. 5 X 107照射灭活 的 P B M C 、 5 X 106照射灭活的人B 细胞以及抗C D 3 单 抗 （终 浓 度 为 30〜50ng/ml) ， 用扩增培养基补充体积至15m l 。将细胞置37°C ， 5% C 0 2细胞培养箱中培养

    4.第 1 天 ，加入重组 IL-2 及 IL-7 各 50U /m l 。

    5 . 第 5 天 ，用新鲜培养基进行半量换液，维持各细胞因子浓度为 50U /m l 。

    6 . 第 1 0 天 ，在显微镜下观察 T 细胞克隆扩增情况。如果母细胞密度较高且培养基颜色变黄，用含细胞因子的扩增培养基将细胞进行 1 : 2 传代。对于生长旺盛的细胞，可每 隔 2〜3d 进行细胞传代。

    经 过 2 周左右时间细胞可扩增约 1000 倍 。在无追加刺激的情况下，细胞可继续培养几周。

    ​

    来源：丁香实验

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