双向电泳各步骤注意事项
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1. 总的策略
① 化学试剂纯度要高,至少是分析级,目前国产试剂达不到纯度要求
② 使用去离子水(电导<2uS)
③ 尿素和丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺需新鲜配制
④ Deionize urea prior to use
⑤ 包含尿素的溶液加热温度不超过 37℃,否则会发生蛋白质氨甲酰化
nbsp;过滤所有的溶液,使用干净无灰尘的容器
2. 样品制备
① 样品提取缓冲液(裂解缓冲液)必须新鲜配制。或者分装成 1ml,于-78℃冷冻保存, 裂解缓冲液一旦溶解不能再冷冻
② 如有必要,在细胞裂解时加入蛋白酶抑制剂。注意:几种蛋白酶抑制剂在 DTT 或b-巯基乙醇存在时失效
③ 40000g 离心 1 小时以去除蛋白提取液中的不溶物
3. 灌胶
① 过硫酸铵溶液需新鲜配制。40%过硫酸铵溶液储存于冰箱中只能使用 2-3天,低浓度过硫酸铵溶液只能当天使用
② TEMED 需在氮气下储存,每 6 个月换一次
③ 带 U 型框的玻璃板需用疏水硅烷处理,避免胶聚合后与玻璃板粘连
④ 水平 SDS 浓缩胶中加入甘油(37.5%)的目的是为了减少电内渗
⑤ 如果 SDS 胶结合于 GelBond PAG 膜上, GelBond PAG 膜需用去离子水洗 6 次,每次 10 分钟, 以避免银染过程中产生点托尾
胶聚合不完全的可能原因 | 解决办法 |
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TEMED 或过硫酸铵时间太长 | 替换 TEMED 和过硫酸铵 |
SDS 胶:Tris 缓冲液的 pH 值 | 用 HCl调 Tris 缓冲液的 pH6.8 或 8.8 |
胶从塑料支持膜上脱落的可能原因 | 解决办法 |
胶聚合于 GelBond PAG 膜的疏水面 | 胶必须聚合于 GelBond PAG 膜的亲水面 |
塑料支持膜选择错误(如:用于琼脂糖胶) | 选择专门用于聚丙烯酰胺胶的支持膜 |
GelBond PAG 膜过期 | 不要使用超过一年的 GelBond PAG 膜 |
胶结合于玻璃板上的原因 | 解决办法 |
玻璃板没有疏水处理 | 玻璃板用疏水硅烷处理 |
4. IPG 胶条的水化
① PG 胶条需水化到 0.5mm 厚
② IPG 胶条的的水化时间取决于水化缓冲液的组成。如果尿素(>8M)和去污剂(>1%)浓度过高,至少需水化 6 小时,最好过夜
③ 采用 Multiphor II 做第一向电泳时,水化后的 IPG胶条需用去离子水清洗,否则 IPG 胶条表面会有尿素结晶,干扰 IEF。(使用 IPGphor 时,IPG胶条水化后不必清洗)
④ IPG 胶条水化时,其胶面与水化盘或胶条槽之间避免产生气泡。采用胶条槽水化时,胶条上需覆盖硅油以防水化液挥发
5. 第一相 IEF
① 采用样品杯上样:样品体积不能少于 20μl 样品在阴极或阳极附近上样,未知样品需检查在何处上样,结果更好;样品浓度不能过高(最大 10mg/ml),以避免在上样位置生成蛋白沉淀。如果怀疑,最好用裂解缓冲液稀释,增大上样体积 样品溶液中不能含高浓度的盐。脱盐或用裂解缓冲液稀释,低电压使样品慢慢进入胶中
② 水化时加入样品 样品溶液体积需根据 IPG胶条大小调整(18cm长 IPG胶条约需 400μl样品溶液),以保证水化后没有多余的样品留在水化盘中。最好检查高分子量蛋白、碱性蛋白或膜蛋白是否进入 IPG胶中
③ 等电聚焦 使用 IPG 胶条时,不要进行预聚焦,否则会因为胶的电导非常低导致样品很难进入胶条;为使样品进入胶的效率增加,采用 30V 低电压水化;继续以低电压梯度(200V,500V,1000V 各 1 小时)进行电泳,最后达到 8000V 的进行电泳;聚焦时间跟 IPG 胶条的长度、pH 范围有关。短的 IPG胶条或宽 pH 梯度范围 IPG 胶条,聚焦时间短 IEF 结束后,如果 IPG 胶条暂时不进行第二向电泳,可于-78℃ 冷冻保存;上样附近有水析出是因为样品盐浓度过高,可脱盐或稀释样品,低电压上样,延长样品进入胶的时间
6. IPG 胶条平衡和第二相(SDS-PAGE)
① 平衡时间应该充分长(至少 2 x 10 分钟)
② 平衡缓冲液包括 Tris-HCl(pH8.8),SDS(1%),高浓度尿素(6M)和甘油(30%)提高蛋白质的溶解度并减少电内渗。第一步加入 DTT(1%)是为了使蛋白去折叠;第二步加入碘乙酰胺是为了去除多余的 DTT(银染过程中,DTT 会导致点拖尾)
③ 对于非常疏水的蛋白或含有二硫键的蛋白,相对于 DTT 和碘乙酰胺,tributylphosphine 更有效
④ 水平的 SDS-PAGE:浓缩胶中加入大量的甘油(37%)是为了减少电内渗
⑤ 水平的 SDS-PAGE:浓缩胶的长度至少超过 25mm
⑥ 蛋白从一向(IPG 胶条)到二向(SDS 胶)的转移为避免点拖尾和损失高分子量蛋白,应缓慢进行(场强<10V/cm)
SDS 胶垂直拖尾的可能原因 | 解决办法 |
水平 SDS-PAGE:浓缩胶长度太短 | 有效的浓缩胶长度>25mm |
蛋白没有被 SDS 充分包裹 | 平衡缓冲液 SDS 浓度>1%,平衡 2 x 15分钟 |
糖蛋白 |
用硼酸缓冲液代替 Tris 缓冲液 用宽范围小孔梯度胶 蛋白去糖基化 |
部分自由的巯基再次氧化生成二硫键聚合物 |
衡缓冲液中加入充足的 DTT,使蛋白烷基化 用 tributylphosphine 代替DTT和碘乙酰胺 |
蛋白发生氨甲酰化 |
含有尿素的溶液加热温度不能超过 37℃ 使用前,尿素去离子化(deionize urea) |
样品制备时,内源的蛋白酶没有被抑制 |
TCA-丙酮处理使蛋白酶失活 加 SDS 或蛋白酶抑制剂一起煮沸 |
GelBond PAG膜使用前没有清洗 | 使用前,用去离子水洗 6 x 10 分钟 |
灰尘或多余的 DTT |
过滤所有的缓冲液 第二步平衡缓冲液中加入碘乙酰胺去除多 余的 DTT |
双向电泳图谱部分变形的可能原因 | 解决办法 |
IPG 胶条中 NP-40 或 Triton X-100浓度过高 |
如果可能减少 NP-40/Triton的量 用 CHAPS 代替 NP-40/Triton |
蛋白从一向到二向转移完成后,IPG胶条没有从水平的 SDS 胶上取走 | 第二向采用水平 SDS-PAGE 时,蛋白从一向到二向转移完成后,取走 IPG 胶条 |
缓冲液条没有覆盖 SDS 胶上原IPG 胶条结合的位置 | 第二向采用水平 SDS-PAGE 时,取走 IPG胶条后,将缓冲液条前移,恰好覆盖 IPG胶条与 SDS 胶结合位置的前沿 |
溴酚蓝迁移前沿不平的可能原因 | 解决办法 |
水平 SDS-PAGE : 冷却板和 GelBong PAG膜之间有气泡 |
去除气泡 |
水平 SDS-PAGE:缓冲液条和胶面结合不好 | 轻压缓冲液条,使其与胶面充分结合 |
SDS 小孔梯度胶灌胶和聚合时不水平 | 采用水平台灌胶 |
7. 银染
①使用纯度高(分析级)的化学试剂
② 使用高纯去离子水或双蒸水(电导<2uS)
③使用干净无灰的容器
④不要用手去碰胶,带手套或使用镊子
SDS 胶上只能看见很少(或没有)蛋白的可能原因 | 解决办法 |
样品制备方法不合适(蛋白浓度低) | 估计样品中蛋白浓度 |
蛋白进入 IPG胶条不充分 | 采用低电场强度开始 IEF |
IPG 胶条和 SDS 胶之间结合不好 | 轻压 IPG 胶条,使其与 SDS 胶充分结合 |
蛋白从一向到二向转移效率低 | 采用低电场强度进行蛋白转移;用去污剂提高蛋白的溶解度 |
IPG 胶条 GelBond 面与 SDS 胶结合 | 水平 SDS-PAGE:IPG胶条胶面朝下 |
银染方法不正确 | 检查方法 |
甲醛氧化 | 用新的甲醛 |
显色液 pH 值不正确 | 检查显色液 pH 值 |
SDS 胶上丢失低分子量或高分子量蛋白 的可能原因 | 解决办法 |
低分子量蛋白没有被充分固定 | 用 20%TCA 或戊二醛代替 40%乙醇和10%乙酸 |
蛋白酶降解高分子量蛋白 | 使样品中内源性蛋白酶失活 |
高分子量蛋白从一向到二向转移效率低 | 采用低电场强度进行蛋白转移 |
胶的背景脏 | 解决办法 |
样品中内源性蛋白酶没有失活 | 使样品中内源性蛋白酶失活 |
银染中清洗步骤不充分 | 进行足够次数的清洗步骤 |
两性电解质和 SDS 或其它去污剂形成的复合物复合物 | 胶固定的时间>3 小时或过夜,充分清洗去除复合物 |
试剂质量差 | 使用分析级或更好的试剂 |
水的质量差 | 电导<2uS |
水化盘或胶条槽被蛋白污染 | 彻底清洗水化盘或胶条槽 |