双向电泳的样品的制备原则、步骤及注意事项

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样品制备原则

样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响 2-DE 结果好坏。目前并 没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1. 尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的 损失;2. 减少对蛋白质的人为修饰;3. 破坏蛋白质与其他生物大分子 的相互作 用，并使蛋白质处于完全变性状态。

根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素(Urea)和硫脲(thiourea);表面活性剂(sufactants)，也称去垢剂， 如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂;还原剂(reducing agents)，最常用的是二硫苏糖醇(DTT)和磷酸三丁酯(TBP)等。当然，也可以选择性 的加入 Tris-base,蛋白酶抑制剂以及核酸酶。

样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合， 以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除 影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐 类小分子 。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压， 甚至会损坏 IPG 胶条，这样都会造成 2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后 续工作的完善或改进获得补偿。

核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生 泡沫;而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。脂类和多糖都可以通过 超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长;也可以采取凝胶过滤或沉淀 / 重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。

因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求 来进行选择。目前有很多方法适于 2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细 胞组份或细胞器 蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白(如磷酸化蛋白、采用 亲合纯化凝集素结合蛋白等)。

一、细胞样品

1. 细胞培养 ，加药与处理。

2. 胰酶消化贴壁细胞，PBS 漂洗 3 次(1500g，5min)，弃上清，再次离心，去尽残液(非常重要!) 。如要比较细胞膜 蛋白组的差别，最好用细胞刮收细获胞。如用 10mMTris/250 mMSucrose(pH7.0)代替 PBS，可有效降低样品的盐浓度。加入5倍体积裂解液，混匀(或将 1×106 细胞悬于 60～100μl 裂解液中) 。

3. 加 50ug/mlRNase 及 200ug/mlDnase，在 4℃放置 15 分钟。

4. 15,000 转，4℃离心 60 分钟(或 40,000 转，4℃离心 30 分钟) 。

5. 收集上清。

6. 测定蛋白浓度( 采用 BioRadRC/DCprotein assaykit)。

7. 分装样品，冻存于-70℃。

二、组织样品

1. 碾钵碾磨组织，碾至粉末状。

2. 将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。

3. 加 50ug/mlRNase 及 200ug/mlDNase，在 4℃放置 15 分钟。

4. 15,000 转，4℃离心 60 分钟(或 40,000 转，4℃离心 30 分钟) 。

5. 收集上清，测定蛋白浓度。

6. 分装样品，冻存于-70℃。

注意事项：

1. 8 mmol/L PMSF 必须在添加还原剂之前用，否则 PMSF 会失去活性。

2. 40 mmol/L 浓度以下的 Tris可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

3. 细胞清洗――大多用 PBS， 若PBS 残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹，则可利用(10 mmol/L Tris,250 mmol/L sucrosepH 7.0)來解決此问题。