细胞传代培养的操作步骤和注意事项？

DMSO是肯定要去除的，其实问题就是DMSO该怎么处理，主要有两种处理方式，一种是加多倍体积的完全培养基稀释，目的是减少再次离心对细胞的影响。另一种就是漂洗后再次离心，目的是尽可能去除DMSO。感觉我附近前者使用较多。

1、悬浮细胞传代

传代流程：

一、直接传代法

① 待悬浮细胞长满至80%~90%（细胞悬液变黄），即可传代；

② 用吸管吸弃细胞悬液1/2~1/3；

③ 加入适量的新鲜培养基，继续培养。

二、离心传代法

① 将细胞悬液转移到离心管内；

② 150g离心5min，弃去上层清液；

③ 使用新鲜的培养基重悬细胞；

④ 吸管吸取适量细胞悬液，装入新的培养瓶，再加入适量的新鲜培养基，继续培养。

2、贴壁细胞传代

贴壁细胞需要用到一种特定的试剂——蛋白酶，其作用是切断细胞和容器之间，细胞与细胞之间的相互粘连，用蛋白酶处理细胞的过程叫做“消化”，“消化”之后的下拨会形成单细胞并从容器底部掉下来。最常用的蛋白酶是胰蛋白酶。

材料准备：

1、预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热；

2、用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手；

3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且减少污染；

4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

传代流程：

1. 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

2. 从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

3. 将培养瓶放入超净工作台后打开瓶口，同时要在酒精灯上烧口消毒。

4. 加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。

5. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

6. 弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。

7. 将细胞悬液吸入10 ml离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以1000 rpm/min离心5 min。

8. 弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

9. 将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

10. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。

11. 继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。

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标准操作是将1ml细胞用37度的水溶解以后，立刻加入有9ml37度培养基的离心管中，然后1000rpm离10min，取沉淀，弃上清，将沉淀加入皿中培养

悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代

贴壁细胞实验需准备超净台喷洒酒精，紫外照射30min。准备好培养瓶/皿，离心管，10%DMEM，0.25%胰酶，D-hanks液等，带上手套，口罩等，倒去旧培养基，用D-hanks液清洗一遍，去除沉积的死细胞等。

加入2ml 0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。加入1～2滴管含有血清的培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。

以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。

注意事项

1、传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

2、每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

3、如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。

是的！细胞复苏后，要立即清洗细胞，去除DMSO。

1. 操作步骤

（1）吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。

（2）向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。

（3）置37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，2~5min后把培养瓶放在 倒置显微镜 下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。

（4）吸出消化液，向瓶内加入Hanks液少量，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液，终止消化。

（5）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。

（6）用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养。

（7） 细胞培养 换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。

2. 注意事项

（1）掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不宜从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。

（2）掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时，消化时间应缩短，过低时细胞消化时间相对延长。

从液氮中取出细胞冻存管迅速放于37℃水浴锅中，晃动冻存管使其快速解冻，小于1分钟。然后于超净台中吸取融化的细胞冻存液加入含有细胞培养基的15ml离心管中，离心，弃上清，重悬细胞，加入培养瓶中培养。细胞复苏DMSO是要弃掉的。