过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳

一、目的

1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程

3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程

二、实验原理

1、电泳原理及影响电泳的主要因素

带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。

带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2）

由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。

另外，迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。

最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。一般最适的离子强度在0.01～0.1mol/L之间。最常见的为0.05。

在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算：

Ⅰ＝1/2ΣmiZi2 (3)

（3）式中，mi为离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数。