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方案16.10 同工酶分析

相关实验:同工酶分析

最新修订时间:

原理

收集细胞,用 D-PBSA 洗涤,重新制成 5×107个/ml 的细胞悬液,制备细胞抽提物并置于 -70°C 保存。准备凝胶装置,取 1~2 μl的细胞抽提物、标准品及对照点样于琼脂糖凝胶。槽内充满液体,将琼脂糖凝胶置于其中,电泳 25 min,加入酶反应试剂,孵育 5~20 min 后,冲洗凝胶,干燥,检査已完成的凝胶酶区带的显示。

材料与仪器

细胞 抽提物 酶底物 核苷酸磷酸化酶(NP) 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD) 苹果酸脱氢酶(MD) 乳酸脱氢酶(LD) 天冬氨酸氨基转移酶(AST) 6-磷酸甘露糖异构酶(MPI) 肽酶B(Pep B)
细胞抽提缓冲液或Triton X-100抽提溶液 缓冲液SAB8.6 D-PBSA 蒸馏水 去离子水
Authentikit装置和试剂 琼脂糖凝胶膜SAB8.6 孵育盘衬垫 孵育盘 染色或洗涤盘 温度控制室的槽盖和槽底 定时电泳仪 安全连接器 孵育室或干燥器 配有1英寸长磁力棒的磁力搅拌器 样品加样器Teflon 头 凝胶记录表 酶迁移数据表 细胞I.D.最终分析表 微升注射器 微量离心机 Eppendorf 管 加样器 加样器吸头 移液管 100ml带刻度的量筒 记号笔 防护手套 装吸头的垃圾桶

步骤

一、抽提物的制备

1. 按常规方法培养细胞达 2×107 个活细胞。

2. 依照具体细胞系实验推荐的方法收集细胞。

3. 细胞团重悬于 D-PBSA 中,计数活细胞。

4. 细胞悬液以 300 g 离心 5~10 min 沉淀细胞,倾去上清液。

5. 重复步骤 3 和 4 , 总共洗涤细胞 3 次。

6. 向细胞团块中加人 100 μl 抽提液(细胞抽提缓冲液(Innovative Chemistry,Inc) 或 Triton X-100 抽提溶液:1:15(V / V),Triton X-100 溶于生理盐水,包含 6.6×10-4 mol/L EDTA,pH 7.1(4℃保存))。

7. 小心地将细胞悬液吸取至小容量移液管中,上下吹吸直至全部细胞裂解。

8. 将细胞裂解液移至 Eppendorf 管(1.5 ml)中,用移液管上下吹吸数分钟直至细胞膜成云雾状并集结在一起,用微量离心机(microfuge) 以最高速度 (约 9000 g ) 离心细胞裂解液 2 min ,收集上清液,等分为所需体积,-70°C 保存。

二、安装电泳装置

1. 打开孵育箱电源。

2. 每个孵育盘内放一个盘垫。

3. 在每个孵育盘中加人 6.0 ml 去离子水,37°C 保温 20 min。

4. 向电泳槽每个盘室中加入 95 ml SAB 8.6 缓冲液(整个电槽中缓冲液的总体积为 190 ml) 该缓冲液不可重复使用,因为电泳过程中 pH 值会有显著改变。

5. 将装了缓冲液的电泳槽通过安全连接线与电压可调的电源连接,电源接地。

6. 将每个温控电泳室盖表面充满 500 ml 冷水(4~10°C )。电泳盖一定要在垂直放置时装满水,否则水将流失。用冰将水冷却或在冰箱中贮备足够的冷水,每次电泳前要更换冷水。

7. 在每种染色盘中加 500 ml 去离子水或蒸馏水,并用它洗涤孵育盘。这些水不能重复使用。

三、电泳步骤

1. 标记每块待用琼脂糖凝胶。可用 Innovative Chemistry,Inc 的标签或用永久性记号笔在凝胶背面作个记号。

2. 将凝胶放在台面上,塑料突起向下。调整凝胶方向使样品孔离操作者最近。

3. 标记每个样品孔,标明将被检测的样品,(如:标准、对照、未知 1、未知 2 等)每块凝胶可检测 6 个未知样品。

4. 将琼脂糖凝胶从坚硬的塑料支持物上小心地剥离。沿着边缘小心处理凝胶,弃去硬塑料支持物。

5. 向样品孔加入细胞抽提物。用装有 Teflon 头的分液器将 1 μl 细胞抽提物精确地加到每个孔中。每个样品用一个新的头。将分子量标准品点样于泳道 1,对照点样于泳道 2,未知点样于泳道 3~8。为避免损伤琼脂糖,只有细胞抽提液滴可接触样孔,点样器尖不能碰孔。若点样量为 2 μl,在第 1 μl 样品散到琼脂糖内后再点第 2 滴。

6. 将每个已点样的琼脂糖胶插入电泳槽盖上,琼脂糖面向外。将琼脂糖胶的阳极(+ ) 与电泳槽盖的阳极(+ ) 匹配,可能需将琼脂糖凝胶轻微弯曲以便插入电泳槽盖。

7. 在每个电泳槽座上放一个电泳槽盖。内部有磁铁的黑端最靠近电源。打开电源(160V),定时 25 min 。

8. 在电泳结朿前大约 5 min 时,从冰箱中拿出每种底物试剂瓶,使其恢复到室温。

9. 临用前加入 0.5~1 ml 去离子水至每个试剂瓶中,轻轻地旋转小瓶使试剂溶解。

10. 电泳结束时,从电泳槽座上拿开电泳槽盖并将其置于吸水纸上。

四、染色步骤

1. 从电泳槽室中取出琼脂糖胶,抓住凝胶膜边缘,向内轻压便可将其从盖中取出。

2. 将琼脂糖凝胶侧立,置于水平放在平面上的吸水纸上,点样孔朝向操作者。

3. 仔细地用不起毛的吸纸吸去琼脂糖胶两端残余的缓冲液。

4. 沿着琼脂糖凝胶膜底边放置一支 5 ml 的移液管。

5. 沿着移液管的前缘将重新制备的底物均匀倾倒于琼脂糖胶上。

6. 用平滑的动作推动吸管经过琼脂糖表面,一次完成,再向操作者方向拖回吸管,在琼脂糖表面推多次,吸管滚动着离开琼脂糖末端,在此过程中移去多余的物质,注意不要破坏琼脂糖凝胶,此步无需加压。

7. 将边缘整齐的琼脂糖胶放在预热的孵育器盘中,琼脂糖面向上,并把盘置于 37℃ 孵箱内 5~20 min 。

8. 孵育后,用 500 ml 双蒸水或去离子水清洗琼脂糖胶两次,用磁力搅拌棒搅动,每次 15 min,第一个 15 min 后,取出每个凝胶膜,将水弃去,加入 500 ml 新鲜水于器皿中,将凝胶膜浸人水中,并予以遮盖避光,确保凝胶膜完全浸入而不是在漂浮清洗液上。

9. 从水中取回凝胶膜,将其放置于孵箱或烤箱烘干室的烘干架内,烘干 30 min 或直到琼脂糖胶干燥,也可将琼脂糖胶室温干燥过夜。

10. 清洁整理,倒掉电泳槽底缓冲液,并用蒸馏水冲洗,将电泳梢盖中的水倒出,冲洗槽盖内部,并晾干。

11. 结果评价,区带是永久性的,凝胶膜也可保存起来,便于将来参考,如果随时间延长,出现背景染色,说明凝胶清洗不够充分。

来源:丁香实验

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