促甲状腺激素标记免疫分析技术检测方法的研究进展

垂体前叶分泌的促甲状腺激素（Thyroid Stimulating Hormone, TSH）的相对分子质量约为25000–28000，与腺垂体分泌的卵泡刺激激素（Follicle Stimulating Hormone, FSH）、黄体生成素（Luteinizing Hormone, LH）以及胎盘分泌的人绒毛膜促性腺激素（human Chorionic Gonadotropin, hCG）一样均为异源二聚体糖蛋白激素。这些激素由非特异性的α亚基与特异性的β亚基以非共价键联结而成。TSH的β亚基决定了其生物学的特性，并且它可能也是激素合成的限速步骤。一般异源二聚体糖蛋白激素的循环水平，以及其活性和作用时间均受翻译后糖基化修饰所调节。

TSH是调控甲状腺细胞生长和甲状腺激素合成、分泌的主要因子。生理上下丘脑分泌的促甲状腺释放激素（Thyrotropin Releasing Hormone, TRH）和垂体分泌的TSH调控甲状腺滤泡上皮细胞合成和分泌甲状腺激素，即甲状腺素（Thyroxine, T4）和三碘甲状腺原氨酸（Triiodothyronine, T3）。TSH分泌受下丘脑–垂体–甲状腺轴的控制和调节，同时还存在甲状腺自身的自主性调节。下丘脑分泌TRH刺激垂体促甲状腺激素细胞合成和分泌TSH，血清内的T3和T4对垂体分泌TSH有负反馈性调节作用。

TSH对甲状腺有重要的促进作用，如对碘的摄取、酪氨酸残基的碘化、甲状腺激素的偶联反应及甲状腺激素的释放等。此外，TSH还作用于甲状腺的许多代谢过程，如cAMP的产生、葡萄糖的氧化、氧的消耗以及磷脂和蛋白质的合成等。TSH在形态学上也表现出明显的作用。注射TSH后，可见甲状腺滤泡上皮细胞从顶端伸出伪足吞噬胶质，胶体小滴出现在滤泡细胞内。TSH的作用持续增强，甲状腺明显增生，腺细胞呈 调控机制高柱状，细胞分裂活动增强，滤泡腔内胶质明显减少等现象。

一、TSH检测的临床意义

甲状腺功能改变时，TSH的波动较甲状腺激素更迅速且显著，是反映下丘脑–垂体–甲状腺轴功能的敏感指标。因此，临床上检测血TSH水平主要用于评价下丘脑–垂体–甲状腺轴的功能状态。甲状腺功能低下、甲状腺功能亢进和克汀病的临床实验室诊断检测中都包括了TSH项目。当血液中TSH浓度≥20mIU/L时，多诊断为甲低；对于甲亢的TSH诊断标准多为小于0.5mIU/L。

此外，TSH不同亚型变化也具有其特殊意义，如TSH-α增高多判断为垂体前叶腺瘤，TSH-β增高主要见于TSH瘤、垂体合成分泌异常、原发性甲状腺功能降低等；临床型特别是亚临床型TSH-β降低可反映甲状腺功能亢进、垂体性及下丘脑性甲状腺功能降低。目前，TSH检测临床多应用于甲状腺疾病的筛查、诊断、治疗效果评判和预后判断。如自上世纪70年代末美国疾病预防控制中心率先开展了长期新生儿疾病筛查工作，及至目前我国卫生部主持的新生儿疾病筛查工作中，涉及筛查项目都包括先天性甲状腺功能低下症（Congenital Hypothyroidism, CH）。

CH是一种甲状腺疾病，是精神发育迟缓的最基本起因，必须在婴儿脑生长完全的6个月之内进行治疗。据报道CH在美国新生儿中的发病率是1/3500，临床治疗结果表明，在3个月之前开始治疗，大约有85％的甲状腺激素缺乏的婴儿可以达到正常的智商（IQ>85）。如果治疗晚于这个时期之后，95％的婴儿将仍保持精神发育迟缓的症状。因此，TSH筛查对CH的预防、治疗和预后均具有重大意义。

1995年，美国国家临床生物化学家协会（US National Association of Clinical Biochemists, NACB）提出以TSH检测为中心的策略评估甲状腺功能：将TSH作为一线测试项目（Front-line Test），根据TSH的测试结果，确定后面的测试，游离甲状腺素（Free Thyroxine, FT4）作为主要的后续项目。

TSH Front-line Test只需要TSH和FT4两项检测就可以对主要甲状腺病变做出诊断。节省了人力、物力，又摆脱非特异性诊断结果的干扰。该方案已经被欧美和亚太许多国家、地区在诊断甲状腺疾病时采用。TSH一线测试之所以能够简化试验项目，关键在于采用了第3代TSH检测技术。

二、TSH的检测方法

TSH检测方法目前已发展至第4代，第3代TSH检测方法现已进入了临床检测实际应用阶段，检测技术不仅大大提高了检测灵敏度，而且为了更好地评价测定结果，国外学者提出了功能灵敏度（Functional Sensitivity）的新概念，它是指批间CV≤20%时的TSH测定值，功能灵敏度的概念与一些仪器生产厂家常用的分析灵敏度（Analytical Sensitivity）的概念完全不同，分析灵敏度是指理论上能够将分析物与本底噪音区分开的待测物的最低浓度值。

这个值一般是一个理想值，并不代表实际检测中可以达到这个数值。而功能灵敏度则是指在实际检测中能够测到的待测物的最低浓度值。这个值一般要比分析灵敏度高，但是由于它反映了实际检测中的灵敏度，所以更有临床价值。功能灵敏度是TSH测定方法分类的基础。此外，第3代TSH检测技术还吸收放射免疫、酶联免疫技术中的精华，结合化学发光、荧光和稀土标记技术的灵敏和探测分析的优势，并通过不断的改进特别是全自动仪器的问世，达到了检测的自动化和智能化。

（1）TSH的第1代和第2代检测技术

临床上最早建立的TSH检测方法是放射免疫法（Radioimmunoassay, RIA），该方法的最低测定值为1-2mIU/L，经过方法学改进后，最小测定值可达0.5mIU/L，但部分正常人的TSH水平（0.4-4.0mIU/L）仍低于0.5mIU/L，故不能区分甲亢和正常甲状腺功能时的TSH差别，需结合TRH兴奋试验检测结果作出诊断。

TSH免疫放射分析法（Immunoradiometric assay, IRMA），被称为第2代TSH测定方法。由于该方法使用过量的标记抗体，可充分反映待测标本中的抗原量，提高了测定灵敏度，可用于诊断正常甲状腺功能、甲亢和甲减。随着抗TSH单克隆抗体的成功制备，该方法的灵敏度可提高到0.1-0.2mIU/L。

TSH免疫酶分析（Immunoenzymemetric assay, IEMA）是以辣根过氧化物酶（Horseradishp- eroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase, ALP）等活性较高、稳定的酶蛋白分子代替同位素标记TSH单克隆抗体，以“三明治”夹心原理建立的非竞争性标记免疫分析技术。借助于酶催化化学反应的放大作用，TSH IEMA的检测灵敏度达0.04mIU/L，明显高于RIA和IRMA。

（2）TSH的第3代检测技术

TSH免疫化学发光测定技术（Immunochemiluminometric assay, ICMA）作为第3代TSH测定方法，是将发光物质标记在抗原或抗体上或作为酶催化底物，通过抗原抗体反应或酶促反应诱导发光，进行测量发光强度的免疫分析方法。ICMA以标记方法的不同而分为两种，即化学发光标记免疫分析法和酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法。前者是用化学发光剂直接标记TSH抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质为吖啶酯类化合物（Acridinium Ester, AE）。化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay, CLEIA），以酶标记TSH抗原或抗体，进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，用发光信号测定仪进行发光测定。

免疫电化学发光分析 （Immunoelectrochemiluminometric assay , IECMA）的反应是在电极表面进行的。发光底物为三联吡啶钌（Ru (byp)32 ），反应参与物三丙胺（TPA）在电极表面失去电子而被氧化，氧化的三丙胺失去一个H 而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物，这一过程在电极的表面周而复始地进行，产生高效、稳定的持续发光，从而保持底物浓度的恒定。

时间分辨免疫荧光测定技术（Time Resolved Immunofluorometric assay, TRIFMA）是八十年代初问世的一项新型的超微量免疫分析技术。荧光的时间分辨技术是利用荧光发射体的荧光寿命差别，将其荧光分开的荧光光谱技术。以镧系元素为示踪剂代替放射性同位素，用具有双功能基团的镧系元素来标记抗原或抗体，当解离下来的镧系元素与特制的扩增液形成新的螯合物时，其荧光明显增强而持久。用延迟测量的办法可消除样品自身的本底荧光，从而大大提高检测灵敏度。

目前，通过对ICMA 的改进，实现了微磁颗粒子标记，建立了功能灵敏度为0.001mIU/L的第4代TSH测定方法。它的测定范围为0.001-0.5mIU/L，主要对TSH在0.001-0.01mIU/L的标本进行再测定，是第3代TSH测定技术的有效补充。

三、结束语

第3代TSH免疫分析技术具有灵敏度高、自动化程度高、所需时间短、无放射性污染等特点，现已从实验室研究进入常规临床诊断应用，并形成一定的市场规模，包括拜耳、雅培、罗氏、PE等公司已有多种自动分析仪器的面市，国内一些科研单位也已自行研制开发了一些简单的化学发光和荧光免疫检测仪器。此外，TSH参考物质的建立，使TSH检测方法的评价将更加科学和统一，检测技术也将会不断地改进和发展，为临床提供更准确可靠的数据。与之呼应，检测市场需要大量与之配套的检测试剂体系。考虑到目前化学发光和时间分辨荧光分析仪器几乎全部为国外厂商生产，而绝大多数厂商采用仪器加试剂盒捆绑销售的垄断模式，并在仪器中人为设置排它性检测程序，从而抬高了配套试剂盒价格，增加了检测成本。开发国产低价、稳定、通用的人血TSH ICMA和TRIFMA试剂盒不仅具有较高的科学意义和学术价值，同时也具有广阔的市场应用前景。