流式检测凋亡的讨论

关于凋亡的流式检测

wanhood

一、PI单染色法

基本原理

其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：

1.细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。

此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。

但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。

试剂与仪器

PBS溶液（配制方法见附录）；

PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。

70%乙醇

400目筛网

流式细胞仪

实验步骤

1.收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

2.3ml　PBS洗涤1次。

3.离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。

4.离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。

5.400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。

6.用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。

7.流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

8.结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。

注意事项

细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

二、Heochst 33342/PI双染色法

基本原理经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。

活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。

此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。

根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。

试剂与仪器

lHeochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保存；

PI染液 ：用PBS配成5ug/ml浓度，4℃避光保存。

400目的筛网

流式细胞仪

实验步骤

1.悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ，终浓度为1ug/ml； 37℃孵育7—10min。

2.低温500 ~ 1000r/min离心5min弃去染液。

3.加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。

4.400目的筛网过滤1次。

5.流式细胞仪分析：Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400 ~ 500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。

6.结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。

注意事项

1.在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。

2.用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。

三、Annexin V/PI双染色法

基本原理

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

试剂与仪器

孵育缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2

标记液：将FITC- Annexin V（宝灵曼公司产品）和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1ug/ml

流式细胞仪

实验步骤

1.细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL　500~1000r/min离心5min，弃去培养液。

2.用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。

3.用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。

4.500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。

5.加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。

6.流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

7.结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。

可能存在一下几种原因:

1、首先是细胞方面:

(1)细胞状态不好(衰老)

(2)流式细胞仪前细胞处理时间过长,如消化后细胞放置时间长,固定不好.

(3)离心过度等

2、检测试剂问题:过期等.试剂染色时间过长等.

3、流式细胞仪:

(1)参数设置不是优化的,可以用正常人血检测机器.

(2)如果是Annexin V/PI双染色法,存在最后结果划线不准问题.

(3)如果PI单染色法,存在没有找到正确的凋亡峰等.

PI染色后，流式细胞仪检测调亡的原理

hanglh：PI染色后，用流式细胞仪检测调亡的原理，及该看点哪些参考书籍和文献。

大灵通：实际上用PI染色根本分不出凋亡还是非凋亡性死亡，只是都按凋亡算了而已，因此用PI染色所得的凋亡率要大于实际凋亡率。

zbbnet：细胞固定后用PI染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系。由于凋亡细胞核酸内切酶活化，DNA降解，细胞DNA减少，因而可在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是凋亡峰。

lard：除左跑gel 之外最平就是他了. (PI 一個flow sample 才RMB 0.6, 不計机的錢)。其實跑gel+PI 已夠說明那東西是會引起apoptosis。用antibody/kit 都是另有要求.

shaman3：其实，PI分不清晚期凋亡和已经死的细胞，在做有关凋亡的流式检测的时候利用的是磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。　　

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

lard：PI 是間接了點, 但PI + 跑gel 是沒有方法中的方法。去ncbi 找一找, 很多paper 也是用PI + 跑gel 罷了.

DONGHAIJU：参考军事医学科学出版社出版的细胞凋亡的分子医学，胡野，凌志强，单小云主编

肠组织匀浆流式细胞检测凋亡的方法

coldant: 请问：肠组织匀浆流式细胞检测凋亡的方法

schoman: 组织检测凋亡还是很难的。匀浆后大部分细胞容易受破坏，应用于流式检测不合适。

关于Annexin V-FITC和PI双染流式检测方法

fjmusy: 我要使用Annexin V-FITC和PI双染的流式检测，需要送到我们医院的流式实验室去由他们做。可是他们没有做过Annexin V-FITC的，只做过PI单染的。

1、不知道这样双染和只有PI 的有什么差别吗？

2、在送检时对标本的量要求多少？

3、结果如何分析？是否要做二倍体（这是什么？说明什么？）分析？

zhaoqingshan: 以前我做过一些，大致如下：细胞要活的，不能固定，你可以用宝赛的试剂盒(电话是是82020225，我刚好也打算做了，身边就放了一张名片)，里面有详细的说明。有些记不情了，细胞是消化下来后，直接加上两种荧光染料，孵育，离心洗去多余的染料，然后上机检测，因为是活的细胞，尽量做到随做随测。结果计算凋亡细胞、死细胞、活细胞的比例或者个数就可以了。它分为四个象限，每个象限代表的不一样

conanthird: 下面是两种染色的原理：磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

方法

1、悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2、贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

3、爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

注意事项

1、整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2、操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。

drake015: 晶美代理benderAnnexin V-FITC试剂盒

目 录 号： LHK601-100

储存温度： 2-8℃

规 格： 100 Tests

有 效 期： 见外包装盒

试剂盒组份

1、结合缓冲液 4x (Binding Buffer 4x)：体积：20ml（4倍浓缩液）；

稀释后溶液中各组分浓度：10mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl2

2、碘化丙锭溶液 （Propidium Iodide）体积： 1.0ml；浓度：20ug/ml

3、重组人Annexin V/FITC, (rh Annexin V/FITC)

来 源：大肠杆菌（E.coli）

分 子 量：35.8 KDa

样 品 量：0.5ml，可用于100次实验

保存方法：于50mM TRIS, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4 溶液中保存

纯 度：SDS-PAGE及反相HPLC表明纯度大于98%

生物活性：Annexin V可结合于磷酯酰丝氨酸并表现出抗磷酯酶活性

应 用：

标记的Annexin V可结合流式细胞仪用于检测细胞外膜上的磷酯酰丝氨酸，操作流程如下：

1、用去离子水按1:4稀释结合缓冲液（20ml结合缓冲液+60ml去离子水）；

2、PBS充分洗细胞，取总数约为5-12.5×104的细胞待测；

3、用250ul结合缓冲液重新悬浮细胞并使其浓度为2-5×105/ml；

4、取195ul的细胞悬液加入5ul Annexin V/FITC;

5、混匀后于室温避光孵育10分钟；

6、用190ul的结合缓冲液洗细胞一次；

7、用190ul的结合缓冲液重新悬浮细胞；

8、加入10ul 20ug/ml的碘化丙锭溶液（终浓度为：1ug/ml）;

9、流式细胞仪（FACS）分析.

实际应用时和使用单位的具体用法有关，最好先去和医院fcm操作者联系一下，核实细胞数、加染色剂的时间以及其他特殊要求。

操作者一般都会给出分析结果。具体也可以和操作者联系，可以详细询问，这里不罗嗦。

我用的就是晶美的产品，就我个人的操作这方面已请教了许多人。仅看产品说明书上的操作步骤还是不行的，不够细。比如最基本的是在冰浴中操作就没有提到。但是现在我的麻烦在于流式细胞仪的操作者不知道双染和PI单染的操作有什么差别，所以不愿意给我作

cyc1sbs5: 单染和双染在使用流式细胞仪时的区别在于双染时需调整两种染料间的补偿,不过着需要一定的经验,你最好还是找有经验的人做吧

dhplc: the difference between single staining and dual stain in annexin v analysis lies on the precision of the results you obtained and,as mentioned above,you must do a complex compensation in dual staining.but any experienced flow cytometry staff has no problem in doing so.

as to your issue,i think it's not you but the flow cytomerty staff to think of this tenichological stuff.if he have not such know-how of setting flow cytometer's compensation and still have interests i'd like to give some start informations.

fjmusy: 我请教了精美的技术人员,确实就如cyc1sbs5说的那样,需要调补偿,也就是图象所在象限的调节吧.

killwhale：我准备将载体转染到细胞后检测细胞的凋亡情况，看了坛子里的介绍，方法有很多，我想用流式双染和DNAladder两种方法来测。但是流式检测的细胞数较高，一般细胞转染用x10的4次方的细胞就够了，但流式检测需要的细胞量远大于10的4次方。请问：

1、流式检测（Annexin V和PI双染）需要的细胞数最低多少？

2、载体转染后，应该多久测细胞的凋亡比较好？

iceblue909:流式检测（Annexin V和PI双染）需要的细胞数最低大概要1×105，最好1×106，一个六孔板差不多就够了。

长江: 流式检测（Annexin V和PI双染）的方法：

1.收集细胞，至少要1.0×105，PBS或Binding buffer洗涤。

2.用Binding buffer重新悬浮细胞，需要的量为1.0×105/100ul。

3.加Annexin V和PI，室温避光孵育15分钟，并摇动。

4.一小时内检测。

至于载体转染后，应该多久测细胞的凋亡，应根据你实验所采用的诱导细胞凋亡的试剂或药物而定。

wkai: 请问采用AnnexinV与PI双染色（流式细胞仪）检测凋亡，操作是否困难？标本若是组织，如何处理？有特殊要求吗？另外，AnnexinV与PI是否需分开购买？有相关试剂盒吗？经费需要多少？

biowind: 流式细胞仪能测组织吗？思考中........

gogowl：不困难，有试剂盒卖。成套试剂盒20次的大概1400元左右，单独买很难搞到Annexin V biding buffer。

midas: 组织进行流式细胞好像没有听说过，但是体内组织进行凋亡检测地方法也很多：如tunnel法，DNA ladder，caspase活性检测等等。

wkai: 我在文献上看到有研究将组织分离为细胞进行流式细胞仪检测，只是没有具体方法，不知是否好做。

fjmusy: 我要用流式检测贴壁的甲状腺细胞凋亡情况，使用光镜，和PI、Annexin V双染色流式细胞仪检测。灵敏度？可信度？价格？操作烦琐吗？总之，对硕士研究生来说，这种方法好吗？还是有更好的方法？

qingshi: Annexin V最可行,应用Annexin V-FITC/PI双染色法是目前检测凋亡的最敏感的方法之一，能检测出早期凋亡细胞，并区分出坏死细胞.

美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的Annexin V产品，简便快速，10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）及Annexin V-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP与PS 的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

因为PI法适用于死细胞(固定细胞)的细胞周期检测较好,对于凋亡,只能看出后凋亡,前凋亡无法看出.而Annexin V是直接对活细胞检测,前后凋亡都可检出.

handshealing: 其实我觉得用PI单染就可以了，老外作流式也是用PI单染的，操作也挺方便的！如果经费有限不妨考虑！

ANNEXINFITC: 不是说Annexin V-FITC是检测凋亡的金标准吗？我干了一年多了还是零。有哪位做过流式Annexin V-FITC检测凋亡的高手能给指点一下迷津？我原本是要做去甲肾上腺素诱导凋亡的，用Annexin V-FITC来检测，可是不论用到多大量的去甲，心肌细胞看起来仍是活蹦乱跳的，Annexin V-FITC也做不出结果。这是国外文献有做不少的，然而我做不出来。

我是这么做的：原代培养的心肌细胞（约500000个细胞/孔，12孔板）状态良好后低血清（1％FBS）培养24h,加入去甲肾上腺素，再培养24h，然后按说明书操作在流式细胞仪检测细胞凋亡率。看人家写的很简单，可是把去甲的浓度都加多100倍了，也得不到阳性结果！我不知道到底哪里错了，是最后Annexin V-FITC的操作有错？还是去甲用的不对？还是加的方法不对？总不会是它本来就没这作用，人家老外都撒谎吧！？

hdhdhd0000: 我没做过，但，问：1、老外是不是用的心肌细胞？2、去甲是否失效？3、做Annexin V-FITC时的操作是否有效？

ymzhao: 我没做过Annexin V-FITC染色的凋亡测定， 但是我在用神经细胞造凋亡模型时有这样的体会， 如果杂质细胞比例大， 则很难造出损伤， 而且细胞状态要好， 才行。实在不行， 先用Hoechst染色观察一下是否有凋亡。

wangzhang: 我虽然没有做过Annexin V-FITC的凋亡检测,但做过其他方法的凋亡检测,感觉需要注意的是一样的,所以我认为你可以从以下几点考虑:

1、去甲是否对心肌细胞有用

2、做凋亡检测时,细胞应该用5%-10%的FBS,而不是1%的FBS,因为在低浓度的血清下,就算什么药都不加,细胞也长不好,这样阴性对照就做不出来了.

3、收集细胞时,应该将培养上清也收集,因为有凋亡的细胞漂起来了.

4、去甲最好买进口的

5、你提到"心肌细胞看起来仍是活蹦乱跳的",我不太明白,因为低血清下,原代培养的细胞48小时也能活蹦乱跳的,有点不可思意,你的细胞没有问题吗?

xindu0524: 你的阳性对照如何？这点很关键。

ANNEXINFITC: 我现在还是没找到原因，还好老板没太说什么，叫改别的做了。不过，原代培养的乳鼠心肌细胞是会搏动的，培养的好的话可以很清楚的看见搏动一波一波地从细胞一端传向另一端并传到相邻细胞，很好玩。唉，就是做不出实验。

echo9450627: 我个人认为凋亡的金标准的电镜检测的照片！

goon：我做过，不过细胞和你不一样，annexin-V 用的是BD公司的

zhongyisheng: 我做了三年的Annexin-V。做Annexin-V法测凋亡只是一个新鲜的假玩意！不管是什么细胞、不管是哪家的试剂都不会有结果的。劝同志们别忙乎了。

Cfhan： ANNEXIN-V实在太贵了，根据经验，5ul就可以标记的非常好，还有为了防止ANNEXIN-V被胞膜内吞造成假阳性，一般在上机前2－5分钟加。

ljksbs：ANNEXIN-V FITC/PI双染试剂盒其实也不是很贵，我5月分才从晶美买的，1700多。个人体会：染色时，ANNEXIN-V FITC和PI分别加2ul和5u就够了。在用结合缓冲液洗涤细胞两遍后，管中留20ul结合缓冲液，如果是室温染，室温避光15分钟就可以了；如果为了保护细胞，在碎冰上染色，避光要染30分钟。在染过色后，在1小时内必须要上机检测。

个人感觉:细胞调亡的形态学观察，姬姆萨染色还是不错的方法。

yyfyjp_0507：ANNEXIN-V FITC/PI双染试剂盒在操作过程中必须注意的是：用0.015mol/lPBS洗2次，加入200μlBinding Buffer和FITC标记的Annexin-V10μl及PI5μl,室温避光30min或4℃避光反应15min,加入400μlPBS，立即上机检测.(加的过程中先加FITC后加PI,因为PI是化学染料,时间长,结果会出现假阳性.

hb：我在用AnnexinV＋PI做凋亡，用的是流式细胞仪。想请教一下如何选择通道，PI是选线性还是对数，还有阴性对照需不需要加AnnexinV和PI（我用的是药物诱导凋亡）。另外处理过的细胞可不可以直接滴在玻片上用荧光显微镜观察，需要加甘油吗？

cyc1sbs5：

1、择通道：一般做双染时, 我们用annexin V-FITC和PI-PE, 根据流式的使用说明, -FITC 用FL1, -PE 用FL2

2、为了观察范围更广, 一般annexin V 和 PI 均选择对数

3、你所说的阴性对照指什么? 是另外一个实验组呢, 还是相同标本的不同染色? 如果是前者, 就需要加班annexin v和PI,后者则不需要

lingzi：阴性对照不需要加annexin v 和pi

hb：我尝试用PI＋AnnexinⅤ作细胞凋亡，但结果发现AnnexinⅤ单阳及PI＋AnnexinⅤ双阳的细胞都较少，而PI单染阳性的细胞则较多，难道死亡细胞（晚期凋亡）用AnnexinⅤ染色不行吗？以上结果是操作有误还是对照选择有误（对照未加任何染色剂）？

midas：您每一次的结果都是如此吗？右上象限：坏死细胞/晚期凋亡细胞，左下象限：正常细胞，右下象限：凋亡细胞。我不敢肯定左上象限到底是什么东东，我们还是问问流式高手吧！

XTYang：机械损伤的细胞会出现在左上，常见于用rubber policeman刮出来的细胞。HB你的compensation好象有问题，该调一调后再做。

另外你必须做一个阳性对照以确保试剂没问题。我曾经历过一个国际著名试剂公司的kit Annexin+做不出来的怪事，虽然最后退了钱，但是浪费的时间、精力和养细胞的开销，555，冤。

zerounion：左上象限是死亡细胞。要做好凋亡最好用单标ANNEXIN V和PI的两管诱导凋亡的细胞调补偿

Annexin v 和PI双标测凋亡散点图

hb: 我尝试用PI＋AnnexinⅤ作细胞凋亡，但结果发现AnnexinⅤ单阳及PI＋AnnexinⅤ双阳的细胞都较少，而PI单染阳性的细胞则较多，难道死亡细胞（晚期凋亡）用AnnexinⅤ染色不行吗？以上结果是操作有误还是对照选择有误（对照未加任何染色剂）？

xdb86：那是你的理解有误，现把Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术的原理给你看看（输出结果中每个象限的细胞数是流式细胞仪根据一个细胞两种染色的想对强弱人为分开的）：

在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin－V是一种35－36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的PS结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻，因而也会阳性。因此，常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin－V标记之外，还会加一种DNA染料，常用的有PI和7－AAD，由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。

下图给出的是在使用FAS单抗诱导前后的检测结果，横坐标是Annexin-V FITC, 纵坐标是PI，左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下象限是存活的细胞，右下象限是凋亡的细胞。

XTYang：你的阳性对照细胞Ann+ or Ann+/PI+多吗？

hb: 横坐标是Annexin-V FITC, 纵坐标是PI,但是左上象限的细胞数却很多.第一张图是对照组

drake015：Annexin v 和PI双标测凋亡散点图，PI到底能染什么样的细胞？如果是能染死亡和晚期凋亡的细胞，那么散点图中UL（上左）象限到底代表什么意思？是不是正常情况下应该不出现散点？

conanthird：the lower left quadrants of each panels show the live cells, which exclude PI and are negative for FITC-Annexin V binding.

The upper right quadrants represent terminal apoptotic cells, positive for FITC-Annexin V binding and for PI uptake.

The lower right quadrants represent the early apoptotic cells, FITC-Annexin V positive and PI negative.

The upper left quadrants showed the necrotic cells.

UL（上左）代表的是necrotic cells(坏死细胞)。

我个人理解：当未加任何处理因素时，左上代表了细胞正常状态下坏死和机械损伤（细胞刮）的细胞，加上处理因素后，该区的比例也明显升高，除了正常状态下坏死和机械损伤（细胞刮）的细胞外，还有处理因素作用后随之引起的相应的坏死。

drake015：楼上说的有道理，但是部分材料也说坏死细胞其膜内侧的ps也会暴露出来，也会有annexin v与之相结合，因此坏死细胞也应该是双标阳性才对，即坏死细胞也应该在上右象限，而上左则不应该有细胞出现，因为没有只有PI单标阳性的细胞，当然个别的还可以接受。像我的图这么多，似乎有点离奇！

检测人的Annexin V 试剂盒可否用于小鼠的凋亡检测

守株待兔：哪位知道检测人的Annexin V 试剂盒可否用于小鼠的凋亡检测？那家公司的小鼠Annexin V 试剂盒比较好？

wolfwg：一般来说鼠和人的基因区别存在相当的保守性，因此许多实验基本是以鼠为蓝本然后应用到人身上。Annexin V 试剂盒检测凋亡的原理和其它试剂盒相近，因此可用于鼠的检测。问题是是否会出现假阳性、阴性，通过设立对照组就可解决。我也曾经做过类似的实验，人的试剂盒用到牛身上。当时问了好多人，没有结果，后来一试真的出来了结果。虽然挺贵，试一试也不白试。

ylcui: 我印象里，检测Annexin V的细胞凋亡试剂盒，好像没有种属的区别。因为Annexin V与检测目标不是免疫结合。Annexin V本身有种属来源差别，但是不影响检测的效果。我2001年的时候，做过Annexin V、PI双染的实验，用同一种试剂盒检测过牛和鼠来源的细胞，结果都很正常。

如有疑问，可以查询Sigma和Clontech公司的试剂盒说明，仔细读一读检测原理。

AnnexinV/PI双染 Kit

spider: 请教Annexin V联合PI双染流式细胞学方法检测凋亡细胞的具体方法，试剂的购买

ylcui: 我给您提供了两个试剂盒的说明书，是CLONTECH公司和ROCHE公司的Annexin V联合PI双染流式细胞学方法检测凋亡细胞的试剂盒说明书。已经发到您的信箱。 其中原理、操作讲得很明确，能够满足您的要求。 购买的话，CLONTECH公司产品找基因公司，ROCHE公司产品代理商很多，但是请您记住比价不能够超过1：9.5，否则就贵了。到货时间都是2周。

如果没记错的话，去年我们花了3600元买了2个50样本的CLONTECH公司的Annexin V联合PI双染流式细胞分析试剂盒。适用于贴壁细胞（L929细胞系、牛软骨细胞）和悬浮细胞（HL-60细胞系），使用效果还可以。

sykes: 用AnnexinV/PI双染做细胞凋亡的兄弟们，有谁做出比较理想的结果呢？你们又是用什么牌子的kit的呢？

chunjung: 我都用Roche的，還蠻好用的，你可以試試看。之前做的結果有些已經發表在Immunology letter上了

mirmaid: 我用的是SIGMA的，很简单。结果也不错，尤其对于悬浮细胞。

yongyuan: 我经常做AnnexinV/PI双染做细胞凋亡，今天上午还在做，效果很好。我是用的BD公司的试剂，方法可以按说明书，不过刚开始洗涤最好用PBS，洗涤好的细胞先加试剂后，立即buffer 悬浮，室温闭光25分钟后加缓冲液0.4 毫升，一个小时内上机，效果好。

Guigli：小弟最近应用Annexin-v-FITC 、PI双染法（流式细胞仪）检测了一种眼部细胞的凋亡，效果不错，试剂也不贵（500RMB 25T）,文章准备最近投稿，感兴趣的朋友可以跟我讨论一下经验。欢迎做过这方面的研究的朋友指教！

Lemontree：图很漂亮，并且信号很强。我有几个问题要请教这位朋友，一个是bing buffer是什么呢？需要自己配吗？ 另外，我理解的是晚期凋亡的细胞和坏死细胞都可以两者阳性，怎莫能够分辨这种情况呢？

guigli: 你说的是binding buffer 吧？就是为了让annexin-v-FITC能与PS最佳结合的缓冲液，不用自己配，试剂盒里有的。好像是理论上讲坏死细胞的细胞膜PS是不会翻转到外层的，所以只能被PI染色，而晚期凋亡细胞才会双染，不知我说的对否？你可以在看一下他们的说明书。

Lemontree：我明白了，就是说不管早晚期的凋亡，Annexin染色都是阳性，而坏死细胞是阴性的。那如果我只想知道凋亡细胞的百分率，是不是只要染Annexin就可以啦？

midas: 坏死细胞的细胞膜都破裂了，PS也一定可以染出来！

pinkhouse: Annexin-v-FITC细胞凋亡检测试剂盒是北京宝赛生物技术有限公司的产品（北京大学医学部的技术-原北医大）。 Annexin V－PI双染试剂盒是北京宝赛生物技术有限公司的产品（北京大学医学部的技术），不是宝生物公司的。其价格为：960元/50T；500元/25T。该产品技术为国内首创，销售网络遍及全国各地，客户普遍反映效果很好。

关于多孔板细胞接种量的问题

littlesilly: 现在要用流式细胞仪来检测HeLa细胞DNA含量（PI染色），请教大家，在上述试验中，一般24-孔和12孔中细胞接种量多大？依据是什么？

zjtcmdzs: 24孔一般每孔接种100000 ，可产出500000；12孔一般可接种100000 ，可产1000000；96孔接种10000，可产出100000。

小毒物：我想用六孔或十二孔板培养细胞,培养48-72小时,最后用流式检测凋亡,请问我应该在培养板内每孔加多少细胞,

yuyr：六孔板接种时每孔可接种5X10 5次方细胞，2.5ml左右液体，12孔板接种时每孔可接2X10的5次方细胞，2ml左右液体。

icesugar75：六孔板培养细胞每孔培养液2ml，十二孔每孔1ml。我们养细胞时，如果十二孔板加1.5ml，培养液就太高了，细胞长不好。不知是不是由细胞的娇气程度导致，我们养COS-7和HC11。

Yali：不同的细胞其生长状态、体积等不一样，有的长的快，有的长的慢，细胞接种数应根据不同细胞及你要求它在什么时间达到多少来决定。可做不同接种细胞数来进行摸索。我在六孔板上做了几个接种数（6x10 5次方、3x10 5、2x105、及 1.5x10 5），发现2x10 5 比较合适

PI和Hoechst双标测凋亡的技术细节

zdwyzhy: 本人用PI和Hoechst双标测凋亡，不知染料应在固定前还是在固定后加。因固定后细胞膜通透性增加，没有凋亡的细胞也着色，不知俺的理解对也不对，

sunandsuny: 你用的是Hoechst33342吗?可以不固定的,具体做法:制备单细胞悬液,加入Hoechst33342溶液,使其终浓度为1ug/ml,37度水浴10分钟,置冰上冷却,离心弃染液,用PBS重悬,加入PI染液，使其终浓度为5ug/ml,置冰上冷却染色30分钟离心去染液,用PBS洗一次,即可以上流式了.

由于Hoechst很容易穿透胞膜,没有死亡的细胞也能够穿入,因此固定对它穿膜没有影响;

但PI通常只能通过凋亡晚期和死亡的细胞膜,我也不知道固定对PI染色有无影响,反正我做的Hoechst和PI双标我没固定.

zdwyzhy:我用的是Hoechst33342，本来我单位的流式是三通道，但只有红、绿和橙色滤光片，双标没法测，打算涂片后用光镜看。

ygtong: 是不能固定的，是因为PI无法穿透活细胞的细胞膜，所以PI首先起到了一个筛选作用，辨别了活细胞和死细胞。Hoechst可以穿透细胞膜，可以染细胞核。在流式上分析的时候，要取无PI的那部分细胞进行凋亡分析。

双标的目的在于排除死细胞对凋亡分析的干扰作用，双标不能固定。

budaoweng: 我做的是神经细胞凋亡，不上流式，而直接用贴壁细胞做Hoechst33342/PI双标，可以吗？效果如何？有谁做过吗？

zdwyzhy: 但看外文文献，凡上流式的，均要固定，不懂！！

little_G: 上流式的以PI染色为多，其他下的染色后的细胞很少需要再培养的，因此多数需要固定或者打孔，否则染色不上。

还有观察凋亡通常从其染色体的倍数上观察。一般认为小于二倍体的细胞群就是凋亡细胞。这一点可以从直方图上看出来。还有关于定量检测凋亡的方法，因为时间久了，具体的记不清了，有一种专门的染色材料可以很清楚地观测凋亡细胞。好像是一种溴化物。

ygtong:可以，不用固定。在培养的细胞中直接加入Hoechst33342/PI双标，因为凋亡小体的膜不会破坏，所以Hoechst33342能染上凋亡小体，而PI是染不上的，因它不能进入完整的膜。利用双标就能够区分细胞碎片和凋亡小体。一旦固定，细胞死亡，膜被破坏，双标就失去其意义了。

ygtong:呵呵，我来总结一下吧。

关于凋亡的检测，方法很多，根据总结，大概由以下几大类：

1、凋亡的形态学观察。

具体步骤很简单：将细胞用药物处理后，用染核的荧光染料染核。直接在荧光显微镜下观察拍照。

2、DNA ladder观察

具体步骤简单：将细胞收集裂解，跑琼脂糖电泳，如果有ladder出现，则有凋亡。

3、用流式细胞仪。

具体步骤简单：将细胞收集理解，用荧光染料染核。

4、用tunel标记

5、anexin V检测早期凋亡

这些方法是按照不同的原理来检测凋亡的。

用荧光显微镜观察主要就是看细胞凋亡小体的出现，而细胞用不用固定主要看你用何种荧光染料（染核）？如果染料可以通过细胞膜，则固定不固定都无所谓。PI是典型的不能透过细胞膜的染料，因此它无法染活细胞的核，如果单用PI检测凋亡，则必须固定。DAPI和hochest染料是可以透过膜的，它们可以不用固定，但平时人们习惯都固定，因为固定了细胞就不会代谢，不再发生变化，有利于长时间观察。

用单个染料检测凋亡，现在通常认为误检率较高，更重要的是，认为它无法区分死细胞产生的细胞碎片和凋亡小体。因此，现在的检测凋亡小体的凋亡试验，如果严谨一点，需要用双标来区分死细胞产生的细胞碎片和凋亡小体。

原理就是PI能染死细胞，hochest都能染，如果看到的聚缩的核能被hochest染上，而不能被pi染，那才是真正的凋亡小体。

而对于流式细胞技术来说，作为一种技术，它有很多很多很多的用途，不只是单单用于检测细胞凋亡。其实它最早好像是作为血细胞分选用的。

现在流式可以用于检测凋亡，用于活细胞分选等等，细胞可以固定可以不固定。只取决于你的试验目的。

即使在流式检测凋亡，根据检测凋亡的原理有三种方法

1、亚G1峰检测

2、tunel标记检测

3、annexin V检测早期凋亡。

在这些方法中，annexin V通常也需要联合用PI进行双标，为什么?同样是为了除去死细胞的影响。

而tunel标记它检测的是DNA断裂端，它本身试验方法就可以区别死亡和凋亡，因此就不需要预先排除死细胞了。

严格意义上来说，亚G1检测也需要双标排除死细胞。

其他

lxk0331: 我用一种质粒转染PC12细胞，观察细胞凋亡，我准备先培养皿上做hoechst33258染色，观察核碎裂，然后再消化下来做流式，不知有谁做过没？

由于做hoechst染色要用多聚甲醛固定细胞，而做流式PI染色时用的是冰预冷的70%乙醇固定的，不知道多聚甲醛对PI染色有没有影响啊？

vanilla006: 本人曾对MCF细胞染色，总体说来，多聚甲醛染色比起70％乙醇的CV值略差，只要细胞处理的好，差别不会很大不会很大影响，也可以试着两步法固定，即多聚甲醛固定半小时后，PBS洗涤后以70％的乙醇固定。

sunandsuny你的意思好像不是用它们两者做双标,我倒是觉得你先用PI染色测凋亡细胞亚二倍体峰型,再用hoechst33258染色一下而且这时不需要多聚甲醛固定了.

其实你也可以做他们的双标检测,不用固定

ze_quan: 在做凋亡的过程中遇到如下问题，请高手帮忙：

1.DNA ladder 跑出来了，但是流式用简单的PI染色看不到凋亡峰

2.流式用pi染色没有看到凋亡，DNA ladder是不是就一定跑不出来。

对此问题，我这样理解，因为PI染色是看DNA含量的，若凋亡发生在G0/G1期，则PI染色应该能够看到亚二倍体峰，若凋亡发生在S晚期，或G2/M期，则流式不一定能看出来。所以第一种情况是可能的。对第二种情况，可能是根本没发生凋亡，也可能是凋亡不在G0/G1期，所以DNA ladder能不能跑出来不一定。就是真有凋亡，DNA ladder也不一定跑的出来。

qingshi： PI染色只能看出晚期凋亡，你说的情况可能是早期凋亡，PI染色看不到，所以PI染色只是分析细胞周期的好办法，而annexin V法是目前同时检测凋亡和细胞周期的最好办法，快速，简易（10分钟）。

ze_quan: DNA ladder是晚期凋亡，PI染色的流式也是晚期凋亡，二者结果也不一定一致吗？

Fang CY: 细胞凋亡的特征性指标之一是DNA ladder,而PI染色指标为为特异性，所以，二者可能存在非相关性。另外，并非在所有情况下，DNA Ladder都能成功。

tangaifa：我做的是贴壁细胞，我用不同的药物浓度去处理细胞，但有些问题让我很为难：

我加药物后，要等合适的时间才能收集细胞做FCM，检测细胞凋亡和死亡情况。如果太早，对照和处理组没有区别，因为药物作用需要时间。如果太晚，细胞死的太多，细胞数量会达不到要求。我现在是用7天时间，中间不能换液，因为上清中的死细胞应该也要加到我最后的细胞比例中。7天处理的结果是有些有差异，有些则和对照无差异。而我的设想是所有处理组和对照组都应有差异。下次我应该延长处理时间，但中间是否应该换液？换液时的细胞上清应该收集吗？

silvia：中间应该换液，否则因营养不够导致的细胞死亡会严重影响实验结果。可以在细胞培养板中进行实验，换液前将培养板离心，使死细胞也沉在板底，轻轻吸出一半液体，补加含等量药物的新鲜培养液即可。

leonhu97：我用的是6孔板，看来换液时只有轻轻地吸去上清，而留下死细胞了。我没用过可直接离心的培养板，不知这种板能否达到10的6次方的细胞量？

silvia：不是专门用来离心的培养板，就是一般的培养板，只是需要特制的离心架子，就象离心管离心也需特定的转子一样。一般实验室都有，可以问问。

tangaifa：我现在准备这样，在药物处理的前期，可以进行换液，也都把死细胞去掉。在处理后期，当基因和药物的作用开始显现时则停止换液了。SILVIA，你认为如何？上次的结果，对照组20%的死细胞（包括凋亡和坏死细胞），处理组60%的死细胞。

qmmq：听师兄师姐说可以把心肌组织磨碎然后过滤网，再利用PI标记后，上流式检测细胞凋亡，但是我做过几次，什么都没有，而且细胞数量很少，上机测的老师说细胞碎片太多，测不出来，请教各位大侠，这种方法可行吗？

crabda：PI标记后通过DNA分析测凋亡，错检的比例比较高吧