关于细胞凋亡的讨论

细胞调亡与坏死鉴别的简便方法 midas

1、PI和Hoechst33342双标：

PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。 故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。我最近在作的试验就是用的这种方法，附上一张我染的PC12细胞的图片，请大家指教。更精确的定量可以通过流式细胞仪来检测。用PI和Hoechst33342双标鉴别调亡、坏死，这种方法简便易行，结果比较可靠。

2、PI和Calcein-Am双标：

Calcein-AM 是一种绿色荧光标记物，可显示胞浆，为膜通透性的荧光染料。Calcein-AM 一旦进入胞内，便可被内源性酯酶水解成绿色荧光物质calcein, 并保留在胞浆中。细胞处于调亡时，由于核成碎片状，从而使此时的胞浆的calcein着色呈碎片状，但是PI为阴性。细胞坏死时，胞浆的calcein染色基本上属于正常，但是PI为阳性，有时可以看到膜内有空泡。但是晚期调亡细胞，胞浆有calcein着色并呈碎片状，而且PI为阳性。

3、PI和Annexin-V双标：

Annexin-V（green）可以和胞膜内的磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。正常细胞膜的磷脂双分子层排列整齐，但是如果细胞损伤时，酯脂双分子层的排列就会被打乱，内层的可能会翻转到外层，Annexin-V就可以检测到这种现象。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的细胞PI是阳性。

可用confocal来进行双标观察计数或流式细胞仪定量检测。

4、Leukostat染色：

活细胞Leukostat染色，核呈棕色，胞浆透明；调亡细胞核浓集，呈黑、褐色，变小，胞浆不可见；坏死细胞溶解呈空壳。 这种方法现在少用。

补充：鉴别细胞调亡与坏死的方法挺多，但大多比较繁琐，我总结的这几种方法则是简便易行，最适合于经费比较紧张的研究生们。

针对朋友的提问，回答如下：

1、试剂来源： PI和Hoechst33342都是sigma公司的粉剂，不是kit，

2、具体方法： 将PI和Hoechst33342的终浓度调到10μg/mg就行，用PBS，Hank's液、生理盐水或D液任何一种溶解都可以。Hoechst33342染色37℃10min就达到饱和，PI在4℃10~20min就行。

3、文献出处：

《细胞实验指南》上册，p102－125，现代生物技术译从－－科学出版社，

有好几篇文献，只列出其中的一个：

Ha HC, Snyder SH.

Poly(ADP-ribose) polymerase is a mediator of necrotic cell death by ATP depletion.

Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Nov 23;96(24):13978-82.

全文链接：http://www.pnas.org/cgi/content/full/96/24/13978

4、鉴别晚期凋亡和坏死的方法我还没有找到，但是这两者要区别是比较困难的， sorry！

fang3326：有什么实验技术可以区分凋亡和坏死啊？

hxc：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测。早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

检测方法：获取11×106细胞/ml的细胞悬液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外线激发，前者荧光为红色（620nm）,后者荧光为蓝色（480nm）。正常细胞蓝色最强。早期凋亡细胞由于DNA的漏出蓝色稍弱并有少量的红色荧光，晚期凋亡细胞红色荧光加强。坏死细胞红色荧光最强。

膜联蛋白（annexin）V标记

正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。PS表面化发生于凋早期，其机制尚不清，可能是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。膜联蛋白V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表现PS结合，再用显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋亡过程中细胞膜PS的表面化。结合PI染色进行双参数检测尚能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。正常细胞膜联蛋白V（-）PI（-），早期凋亡细胞膜联蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞膜联蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜联蛋白V标记仅有不到三分之一的凋亡细胞出现阳性标记，其原因尚不明。同时需注意度的是凋亡后期溶解阶段，细胞碎片也可出现明显的阳性着色。

mayar：最简单的方法是使用PI染料流式细胞仪或者荧光显微镜检测，因为只有死细胞才可以被染上，而早期凋亡的细胞是不会被染上的。如果只是检测的时候去除坏死细胞的干扰的话，比如使用Annexin V检测凋亡的时候，只需要和PI进行双染就可以了。只有Annexin V阳性而PI阴性的细胞才是凋亡的细胞

hjjackie2004：pcd形成凋亡小体，电泳检测能看出梯状带。坏死是如线粒体肿大。。

fflying：几点供参考：

1、大部分凋亡细胞可能并不见得有非常典型的凋亡表型，如电镜的染色体边集、凋亡小体等，DNA电泳也不见得都有DNA ladder，但对某些指标来说还算稳定，如PI染色及TUNEL法，所以如果某个方法效果不好，可以换用其他方法检测

2、坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程，楼上所说的线粒体肿大也是以前的一个传统认识，但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的，因此也有了程序化坏死一说，在很大程度上，由于凋亡是时间依赖性的过程，细胞发生凋亡也并非同步化的，凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的，而且我认为如果不是对于凋亡或是坏死本身通路进行研究的话，强行区分是没有意义的

178：供参考：

1、可以测细胞的电解质透性,坏死的细胞他的细胞膜通透性增强,包内液体甚至一出来,通常所说的化脓就是这种情况的最好表现;而凋亡的细胞绝没有上述情况,他会出现皱缩,内部细胞器的分布也会发生一些变化一形成凋亡小体

2、可以测两中类型细胞的DNA,他们的总DNA电泳分离,凋亡的细胞会出现相差180NT 的梯度条带,而坏死的细胞则没有

悬浮细胞原位杂交合荧光标记检测凋亡

pljgirl: 请教悬浮细胞原位杂交合荧光标记检测凋亡的经验。我现在想拿这些悬浮的细胞检测其凋亡情况和做原位杂交，不知道细胞如何贴到载波片上，应该用何固定液固定？固定后如何保存？

XTYang: 用Cytospin甩到载玻片上。固定用甲醇、乙醇、paraformaldehy都可以，要根据具体实验而定的。

pljgirl: 我的细胞是加了一种新药，不同的剂量，想看药物诱导细胞凋亡的情况，用cytospin时每组细胞要求甩的细胞数一样吗？因为我收的时候，发现对照组的细胞很多，最大加药组的细胞少得很，如果用同样得体积，可能对照组的细胞重叠了，而加药组的确很稀疏。所以甩细胞时要准确计数吗？

XTYang: 用cytospin时每样品的细胞数最好大致一样，不然照相时细胞少的那个样品就很难找到好视野。太多细胞重叠也不行。我印象里是10^4-10^5个,不过不很肯定，你做个试验看看镜检结果就知道了。既然是大致，就不必准确计数。

pljgirl:那这样的话，将来片子还用于统计吗？我看到有些文献上说在对阳性部位进行分级，<25%为阴性，25%~50%（＋）>50％（＋＋）等，那如果不精确计数，甩的细胞数目不一致，怎么有可比性呢？

XTYang: 凋亡%可比

pljgirl: 你意思是说，用流式细胞仪检测凋亡率来比较，甩片只是为了获得形态学的标记，不用比较凋亡率吗？

XTYang: 不是。镜检可以同时获得形态和凋亡率的数据(虽然数起来辛苦)，因为不管你甩多少细胞上去，其中的凋亡细胞占总体细胞中的%是固定的，因此用CYTOSPIN时细胞计数不很准确也不要紧，应为%固定。甩细胞时计数不必准确不等于镜检计算凋亡细胞%时计数不必准确。后者尽量准确为好。

pljgirl:再请教一下，我想做荧光标记凋亡和细胞的原位杂交，但现在还没选好试剂，可能会用promege的tunel，原位杂交也没想好要检测rna或dna，只是想甩片后固定，将细胞保存在－80度，做这两项内容的细胞都可以用4％的多聚甲醛在4度固定30分钟就行了？听说做rna的原位杂交固定用的多聚甲醛要用DEPC水来配，又相关经验提供吗？

XTYang:我没试过先保存一段时间然后再做的方法。一般固定后就直接做了。普通的用-20度甲醇或乙醇固定2-16小时，需要用多聚甲醛的话，可以在甲醇或乙醇固定后再进行。

做rna的原位杂交固定用的多聚甲醛要用DEPC水来配的说法我没听说过，希望你做了以后和大家分享成功经验。

pljgirl:我也是在丁香园里看到别人建议的，其实也有点道理，DEPC水是去rna酶的，感觉做rna的实验就是要严格很多。我在现代病理学技术中查到做原位杂交一般都是用4％的多聚甲醛固定，再用80％的乙醇后固定。由于我的细胞已经收集好冻存了，解冻后马上要甩150多张片，现在急啊！万一固定方法不对。我的损失会很惨重！悬浮细胞的固定是在率片前还是再率片后呢？

XTYang: 我学的做的都是先甩后固定。

关于凋亡率

sabc128：我做的是药物作用于细胞一定时间后，计算细胞的凋亡率是多少？有那些方法？

youngtiger：可以通过以下三个方面着手：

（一）通过凋亡形态学：常规染色（HE, Giemsa, Wright）的普通光学显微镜观察，随即选择视野进行凋亡细胞计数；透射电镜观察。

（二）通过凋亡的生化特征检测：琼脂糖凝胶电泳末端标记定量检测；原位末端标记检测（TUNEL等）

（三）通过流式细胞仪：PI单染色法；TUNEL的流式分析等

总之方法很多，这里不能一一详细介绍，你可查一下相关实验方法的文献，要根据你的具体情况而定，本人认为如果条件许可，最好通过流式检测，误差小。

sabc128：假如用HE 染色,凋亡细胞和整个细胞数目怎么确定?

youngtiger：细胞爬片或涂片的HE染色结果判断：凋亡细胞变圆、边笑，细胞核固缩、碎裂，染色体被染成深蓝色或蓝黑色，可见细胞膜皱折、卷曲，甚至芽生形成膜包裹的凋亡小体。正常细胞经染色后仍保持细胞原有的生长形状，核规整，染成均一蓝色。而坏死细胞肿胀，可见细胞膜的连续性破坏，核染色体染成很淡的蓝色甚至消失。

可用凋亡指数进行计数，即随即选择约10-20个视野，计数凋亡细胞百分率。

woodsword：有一篇文章，可能对你有点用。

Acta Physiologica Sinica, October 25, 2004, 56 (5): 609-614

xdb86：常规染色（HE, Giemsa, Wright）普通光学显微镜观察和透射电镜观察要计算凋亡率是很困难的，基本上不可行。常规染色下要出现明确的凋亡小体你才可以说该细胞凋亡了，早期的和不出现凋亡小体的凋亡无法辨认。透射电镜观察的细胞数太少，有时也不易与坏死区分，可以定性，也不宜计算凋亡率。

琼脂糖凝胶电泳可以比较不同组别的凋亡程度，但不能得出凋亡率。

TUNEL法太敏感，有DNA断裂的细胞应该都能着色，所以很多人做出的结果不是绝大部分阳性就是全部不着色（可能试剂问题或实验操作问题）。

PI单染色法流式分析：多用于检测细胞周期分布。早期凋亡细胞也可以检测到，表现为亚二倍体峰。

我觉得检测凋亡率最好的方法还是Annexin-V-FITC/PI双染色、流式细胞仪分析法，可以得出明确的凋亡率，并区分坏死细胞，其原理是：在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin-V是一种35－36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的PS结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生坏死的细胞其细胞膜上的PS也外翻，因而也会阳性。因此，常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin-V标记之外，还会加一种DNA染料，常用的有PI和7－AAD，由于坏死的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出坏死细胞。

LXMSUNLIGHT：

1、流式细胞术检测细胞凋亡率

2、AO/EB荧光染色 （Wang CY, James E, Jim L. Spontaneous apoptosis in human colon tumor cell lines and the relation of WT P53 to apoptosis. Chinese Medical Journal, 1996;109:537-541）

方法略有改进：将处于对数生长期的2株细胞制成细胞悬液，调成1×109/L细胞密度加入细胞培养瓶，待细胞贴壁后加入2mg/L As2O3药物. 置37℃ 50mL/L CO2孵箱培养，按预定时间，将细胞全部收集离心，弃上清加入PBS洗十次，制成细胞悬液，吸200μL，加入8Μl AO/EB染液，充分混匀，滴于玻片上，分别计数. 早期凋亡细胞（VA）核染色质着绿色，呈固缩状或圆珠状. 晚期凋亡细胞（NVA）核染色质着桔红色，呈固缩状或破裂状. 坏死细胞（NVN）核染色质着桔红色，呈正常细胞结构. 活细胞（VN）核染色质着绿色，呈正常细胞结构. 细胞凋亡率按以下公式计算：

细胞凋亡率%=VA+NVA/VN+NVN+VA+NVA ×100%

如何检测石蜡包埋的组织切片标本的凋亡情况

sorry：本人想检测石蜡包埋的组织切片标本的凋亡情况，除了传统的Tunel法以外，还有什么其他的方法吗？

xufei19750125：也可以用免疫组化法检测Fas、Bcl-2等凋亡分子！

ljksbs：对石蜡包埋的组织切片可以用HE染色来对组织切片中调亡细胞进行形态学观察，如果用免疫组化检测Fas、Bcl-2等调亡基因的蛋白表达，有助于解释其调亡机理，对检测调亡情况无多大帮助；流式仪对单个细胞悬液可以检测调亡，但是对组织切片是无法检测的，但是对还没做成组织切片的石蜡标本可以制成单细胞悬液来进行流式检测，但是过程比较复杂，不好制备，因此，不提倡用。因此，检测石蜡包埋的组织切片最好的办法还是TUNEL法，还可以结合HE染色观察调亡细胞形态学改变，再结合免疫组化检测Fas、Bcl-2等调亡基因的蛋白表达来解释其调亡机理，已经足够了，

tjbone：采用免疫荧光检测Fas、Bcl-2等凋亡的细胞也是可行的方法。

DEVELOPING A NEW METHOD FOR DETECTING ISLET APOPTOSIS

萧萧湖：我要建立一个胰岛细胞凋亡模型，想请教一下可以用什么方法检测凋亡的细胞。那一种比较好。situ TUNEL technique 的原理那里有详细的介绍啊？

jmtang：DEVELOPING A NEW METHOD FOR DETECTING ISLET APOPTOSIS

Miami Nature Biotechnology Short Reports

TheScientificWorld (2001) 1, 32SR

ISSN 1532-2246

Al-Abdullah, I.H.*, Cabrera, O., Inverardi, L., Pileggi, A., Pugliese, A., and Ricordi, C.

Diabetes Research Institute, University of Miami School of Medicine, P.O.BOX 016960(R134), Miami, FL 33101, USA
 
iabdullah@med.miami.edu

INTRODUCTION. Current islet cell isolation procedures can only retrieve a portion of the total number of islets present in the pancreas. One factor affecting islet yield is a variable level of apoptosis that is associated with mechanical and chemical isolation procedures. A quick and reliable method to assess apoptosis would be therefore useful to determine the overall quality of final islet preparations. We have tested PhiPhiLux, a recently developed method for early detection of apoptosis, in isolated pancreatic islets.

METHOD. Human (n = 3) and porcine (n = 2) islets were isolated by the automated method and density gradients purification (1). Aliquots of highly purified islets (>95%) were cultured at 37°C and 5% CO2 in CMRL medium (Human) and complete TC199 media (Porcine). Viability and apoptosis were assessed within 24 hr of isolation (fresh islets) and after 7-14 days culture. Viability was assessed using fluorescein diacetate and propidium iodide (FDA/PI) staining. PhiPhiLux (OncoImmunin, Inc) is a fluorescent Caspase substrate more specific for caspase 3 like activities. It is uptaken by live cells and can be used to detect early apoptotic events in cell lines and lymphocyte populations (2). The fluorescent signal is similar to that of FITC. 200 IEQ from the fresh and cultured cells were stained with PhiPhiLux (50 µl and 10% FCS) for 45 min at 37°C, washed and mounted with an antifade reagent (Molecular probes) and examined using a fluorescence microscope. The entire staining procedure takes about 90 minutes.

RESULTS. Islet viability as assessed by FDA/PI staining appeared to be very well preserved in both fresh and cultured islets (90-95%). Subjective evaluation of the PhiPhiLux staining revealed that less than 1% of fresh human and porcine islet preparations stained. Among cultured islets, PhiPhiLux stained approximately 5% and 10% of porcine islets after culture for 7 and 14 days, respectively, while approximately 2% of human islets were stained after 7 days or more.

DISCUSSION. Our results show that PhiPhiLux can be successfully used to assess apoptosis in fresh and cultured pancreatic islets. This method is rapid and simple providing a valuable alternative to more cumbersome methods, such as TUNEL and Annexin. Very limited number of islet cells was apoptotic after isolation using the methods reported here, but increased apoptosis was detected in cultured porcine islets (5-10%). The ability to detect apoptosis in human and porcine pancreatic islets with this method must be further verified by comparing PhiPhiLux staining with more conventional apoptosis detection methods (i.e., TUNEL and annexin staining). This preliminary report simply illustrates the technical feasibility of a recently described approach to detect apoptosis in islets. If validated by further experiments, this rapid apoptosis detection method could be of assistance to evaluate pancreatic islet preparations before their use in research and transplant applications.

REFERENCES.

1.Ricordi, C., Lacy, P.E., and Scharp, D.W. (1989) Diabetes 38(Suppl. 1), 140-142

2.Komoriya, A., Packard, B.Z., Brown, M.J., Wu, M.-L., and Henkart, P.A. (2000) J. Exp. Med. 191, 1819-1828 [check Medline]

DNA片段原位标记

Uhouuhou

凋亡细胞DNA片段原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate,UDTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidy1 transferase,TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3'的羟基（-OH）端相结合经显色反应后检测DNA裂解点的技术。

DNA片段原位标记法有两种：（1）原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT）技术，该技术是1994年由Fehsel等提出，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸接到断裂的3'-OH端；（2）原位缺口末端原位标记技术（in situ end labelling technique,ISEL）, 该技术即TUNEL法,于1993年由Wijsman等提出， 它是利用TdT将标记DUTP接到3'-OH端。研究证明，TUNEL的敏感性远高于尤其对早期凋亡的检出TUNEL更为适用。其原因可能是凋亡发生时DNA大多是双链同时断裂而单链断裂少见。ISNT是依赖DNA多聚酶I的单链修复反应，故阳性率较低。细胞凋亡时DNA断裂早于形态学改变及DNA含量减少。因此该法较前述各法具有更高的灵敏性，但环死细胞亦有DNA裂点形成。因此环死亦可呈TUNEL阳性反应。

有没有可用于96孔培养板的细胞凋亡试剂盒

brightpearl：我欲观察多种药物对神经细胞凋亡的影响，工作量较大，现市售细胞凋亡试剂盒TUNEL用于培养皿。有没有可用于96孔培养板的细胞凋亡试剂盒？

XTYang：bdbiosciences下属clontech子公司有的

个人做调亡的体会  ljksbs

如果是做细胞调亡的形态学观察，姬姆萨染色比较好；现在检测调亡比较流行的是Annexin-V FITC/PI双染，将细胞分为正常细胞，早期调亡细胞，晚期调亡细胞或继发性坏死细胞，机械性损伤细胞四个区域，比较敏感，不错。

DNA Ladder 法检测细胞调亡，是检测细胞的晚期调亡，但是注意此法虽为检测细胞调亡经典的方法观察阶梯状条带，但是不是很灵敏，如果晚期调亡率少于10％（有的说是30%）很难观察到断裂的DNA 阶梯状条带。

PI单染是检测晚期调亡，但是如果早期有调亡无法发现。

ELISA法检测细胞调亡现已很少见有文章使用。

还有一种检测调亡现在比较时髦的是TUNEL法，此法最为经典的是观察组织切片中的细胞调亡情况，也可以用于观察单细胞悬液的调亡情况，但是需要做细胞爬片，有一个缺点是如果是人工计数的话，误差比较大，国外的文章都是电脑计数，这样比人工要准确，但是由于经费问题，现在国内使用此法人工计数的不在少数，因此这样可信度就不高。

如果要探讨调亡机理，可以结合免疫组化法来检测如bcl-2,fas等调亡蛋白的表达。

ELISA方法检测淍亡的原理 DONGHAIJU

细胞凋亡时，Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断，产生单或寡合苷酸小体，各核小体的DNA与核组蛋白H2A,H2B,H3,H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。

其他

雕刻者：我准备做一些肿瘤的石蜡标本。 我想提取里面的血管内皮细胞，然后用流式观察它的凋亡情况 。我想问的是根据单细胞悬液制备后如何能分离出血管内皮细胞？ 另外是否有必要用流式还是用TUNEL法就可以了

yqzhan：做成蜡块的组织被固定了，蛋白质变性，细胞间的连接被固定，加上固定液加强了细胞间的交联，理论上是不可能进行分离的。 为什么不直接在组织切片上进行凋亡检测呢？

eeflying：血管内皮不用分离，作双标就可以了。 建议在流式专区问问， 这对于他们挺简单的问题。

dinki：有一个困惑的问题：在我看来，细胞流式仪检测凋亡既可以定性又可以定量，那为什么绝大多数实验室仍要同时用TUNEL法来进行定性呢？而且，现在对于TUNEL法检测凋亡存在一定的争议：并不是只有发生凋亡的细胞表现TUNEL（＋）。那么对细胞凋亡的检测是否只需细胞流式仪就足够了呢？

midas：我认为：因为目前除了电镜是检测凋亡的金标准外，其他的方法均有一定的不足，所以一般都会用到两种以上的方法对细胞调亡进行检测，如：流式＋荧光染色，荧光染色＋DNAladder等等。

TUNEL的方法是体内试验时检测调亡的常用方法，而流式对体内细胞的调亡则无能为力。

XSQ：我最近的实验很不顺，我将载玻片用左旋多聚赖氨酸包被后放与六孔板中，但是很容易污染，不知各位高手有何高招．

midas：载玻片、PLL、六孔板、培养液及玻片确保无菌，最重要的无菌操作技术！

haiyang777：老师上课时说过，如果以细胞凋亡电镜照片为证据时，一定要同时附带一张细胞大量凋亡的光镜照片以说明问题。因为正常细胞也会有凋亡发生，只有电镜的不能说明问题的。

tangjia007:我原代培养小鼠皮质神经元后，想检测细胞淍亡情况。我是通过以下方法来测的，但结果不好。倒掉培养基，用PBS洗一次，用胰酶消化后倒掉胰酶，然后再用PBS悬浮收集细胞，抽提DNA，电泳。请教各位老师，是不是我的收集细胞的方法有问题？您们是怎么作的？

midas：细胞的密度是多少？什么方法损伤细胞？抽提DNA的步骤是什么？

tangjia007:细胞密度:1000000,谷氨酸诱导凋亡,抽提DNA我是用的试剂盒

midas：细胞的量是够了，不知谷氨酸诱导凋亡后的形态学明不明显？

tangjia007:在形态上看不出来

midas：可以用荧光染料如hoechst先鉴定一下下，如果加入Glu后有核的改变，再用tunel也不迟！

lele781101:请教做凋亡的物廉价美的方法有否？花钱不多的，抗体太贵了。

midas：作hoechst染色和DNA ladder都不贵！

linger:我做的是神经元细胞原代培养，所养的细胞除了神经元细胞以外不可避免的会有一些其他的细胞如胶质细胞等等，但是我只想检测神经元细胞的凋亡，不知用什么方法合适？

midas：如果有条件可以在confocal下作tunel和神经元marker（如NeuN，β-tubulin）的双标记！

celia_:细胞凋亡是否也可以用Rodamine123和PI加以检测？用荧光染色的方法挺多的，如AO/EB、Hoechest/PI等方法，想请教这几种方法有没有区别，检测效率如何？

midas：Rodamine123可以检测线粒体内膜的跨膜电位变化，细胞调亡时线粒体内膜发生变化从而导致跨膜电位的降低，这时Rodamine123的荧光染色减低。由于线粒体改变发生于细胞调亡的早期，所以用Rodamine123应该时可以检测调亡的。PI则主要检测坏死或晚期调亡（二者的膜都发生了破裂）。

AO/EB、Hoechest/PI等方法都时检测调亡的手段，至于它们的检测效率我没有作过比较，sorry！

pengwenf09 :我想作大鼠的骨组织切片的细胞调亡检测，想请问，是否要先将骨组织脱钙？另外，因实验条件限制，没有荧光显微镜和共聚焦显微镜，请问我如果想用TUNEL法检测用那种酶标效果较好？

midas：既然没有荧光显微镜和共聚焦显微镜，那就用生物素酶标的吧，DAB显色。不过好像比较贵！

mduza888:我在做MTT时，由于酶标仪的490nm波长坏了，就用450NM波长来测量，不知是否可以？

midas：一般都是490nm或570nm，450NM的我不太清楚。

georgia116:在做细胞凋亡检测时，有没有必要将电镜，流式细胞术和TUNEL三种方法结合起来一起做，这样做也许说服力更强，但这样做是不是太浪费时间？能否给我一个好的建议，既效果好，又能节约一些时间。

midas：选择两种就可以了。流式细胞术和TUNEL都比较方便！

太平亦人：我做过450，虽然和490的数值不一样，但是作的曲线趋势一样

icepiao:我想测一个药物对诱导细胞的凋亡，在荧光显微镜下用AO/EB复染可以看到很明显的凋亡，高浓度时细胞死亡较多，中浓度时视野中大部分是黄色的细胞，然后我用上流式细胞仪检测，染色剂是PI，预计会出现凋亡峰，但是没有出来，这可能是什么原因呀？

midas：PI是检测坏死的呀，检测调亡应该同时用annexin-V。

carrotloving:用药物诱导肿瘤细胞凋亡。昨天做MTT实验时，药物作用不明显，但该药物的确可诱导这种细胞凋亡。我在96空板中加的细胞的量为undefined104，我不知道是不是因为肿瘤细胞体积较大，细胞密度过大的缘故，请各位高手指教。

midas：个人认为MTT法并不是检测细胞凋亡的合适方法，应该用其它的方法来检测您的结果！

雨落忘川：石蜡切片神经细胞凋亡检测只用TUNEL法是否太简单？我现在准备做凋亡，不知道具体用什麽方法才好。

midas：最方便的方法是再加一个DNA ladder实验.

linger:我做的是神经元细胞原代培养，所养的细胞除了神经元细胞以外不可避免的会有一些其他的细胞如胶质细胞等等，但是我只想检测神经元细胞的凋亡，不知用什么方法合适

midas：如果有条件可以在confocal下作tunel和神经元marker（如NeuN，β-tubulin）的双标记！

pengwenf09：我做大鼠骨组织切片的细胞凋亡，如果要 用电镜来检测的话，是否新鲜取骨后，先用10％的福尔马林固定24小时后，脱钙，然后在切成1mm厚的片子，制成电镜标本，在按照具体要求操作？

yunfenglin：作电镜检查不可已用福尔马林来固定啊会严重破坏细胞内结构。最好选用4%戊二醛 其次为多聚甲醛。固定时间不同的人有不同习惯。脱钙最好交给电镜室的人来做，不要自己脱钙。切记固定液不用福尔马林啊。

Greenhand：我想问一下做SRB的波长应该是多少呢？我在文献上看到490－530nm均可！我现在在这范围的只有490nm的，可以吗？还有在做流式检测凋亡的时候，细胞是否需要同步化，具体方法是什么呢？

icepiao：是那个和MTT类似的细胞染色剂吗，我用MTT时的感觉是：每个波长下的趋势都差不多，差别是灵敏度不一样，一般都是好几个波长取灵敏度最高的，所以我想490nm应该是可以的。至于凋亡，我现在一直为这个头疼呢，至于同步化，我都做过，好像对细胞周期的测定有影响，对凋亡影响不大。至于方法，有血清饥饿法，秋水仙法等等，很多细胞学的大厚本上都有。

fibril:如果我要想做细胞凋亡实验，是否必须使用原代细胞，如果用建株后的传代细胞是不是效果会不好。另外就是实验中我想使用阳性对照，不知道用什么方法诱导细胞调亡在实验中比较可行（我用的是内皮细胞）。

midas：不必非要使用原代细胞，传代细胞完全可以。缺血缺氧，过氧化物损伤都是常用的诱导调亡的方法！

biofish：不必非要使用原代细胞，传代细胞完全可以。

缺血缺氧，过氧化物损伤都是常用的诱导调亡的方法！不过,最好用DNAse消化作阳性对照．不过，记得防止酶污染，DNAse很厉害的，要用高温烘烤８小时的．

seastar:这么多检测方法，应该适合不同的细胞类型，但是看完后觉得比较混乱。能否说明一下，我做的是K562悬浮细胞，检测凋亡一般采用哪几种方法结合比较合适？

Luck-tang：我个人认为一般从两个角度来选检测指标：一个角度是凋亡的不同时期，比如说你可以选择2-3个凋亡不同时期的指标；另一个角度是不同的方法学，刚才选择了不同时期的指标，但你最好不要用同一种方法去检测所有的指标，而应错开来，比如用流式检测早期凋亡Annexin-V，那么晚期的指标就可以换一种检测方法如提取DNA来检测DNA Ladder，或着TUNEL法等。当然你还可以选一些直接就从形态学就可以反应的指标，如瑞氏染色或别的DNA特异性染料染色直接在显微镜或荧光显微镜下可以观察的。据我所知K562的DNA Ladder不是很好做，不过你是学分生的有条件多炼几次。

lumangmang：如果流式细胞仪检测我的细胞处理后只有30%左右的凋亡，而且大都是早期凋亡，请问能不能做DNA LAdder。如果我检测了处理后的Caspase的变化，是不是加上流式的结果就能说明问题了？

Luck-tang：当然可以，如果你要做DNA Ladder的话，它是晚期凋亡指标，所以你可以选择处理时间较长一点的就行。一般来说两个指标也可以，但有三个不同时期和水平的指标更好！

三国孔明：我也做PI，也做DNA ladder，凋亡率超过15％就可以做DNA ladder了，但是细胞的数目一定要够多，不然凋亡细胞的DNA很难提取出，这只是我的一点经验，如有不对，请大家指正。

dr_wayne：DNA LAdder好像只可检测晚期凋亡，如果只有早期凋亡，估计做不出来。

XSQ：我最近的实验很不顺，我将载玻片用左旋多聚赖氨酸包被后放与六孔板中，但是很容易污染，不知各位高手有何高招．

ttdcs：看样子你是准备让细胞长在载波片上，其实实验过程中，以我的经验而言（至少是对于昆虫细胞，鱼类细胞都经过实验验证），载波片不用包被直接灭菌后放入六孔板中（无菌操作，可用烧过的镊子夹载波片放入即可）然后向孔中先加入少量培养基使孔和载波片经润后，再向其中加入细胞悬液后静止培养，待到细胞贴壁后再做后续处理就一切ok啦，呵呵，我做细胞凋亡染色的时候都是这么做的，效果不错（附上我的论文一篇，希望对你有所帮助http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=38&id=935123&sty=1）

兰色的兔子：请问除了流氏细胞仪外有没有其他的方法可以定量检测细胞凋亡，我的实验经费很有限。

dr_wayne：好像没有，可是流式切实比较贵，我有同感

dengfugang：如果用PI染色后用CELLquest进行细胞获取和分析，应该如何设门，还是不设门？应该如何分析？

yundtg：获取时，可不设门；分析时，需用FL2-A VS FL2-W 排除粘连细胞，并注意FSC VS SSC 信号。