简介
组织形态异常的原因一方面可能是受炎症因子或其他信号分子刺激下发生整体组织结构改变，也可能为发育期细胞增殖、凋亡异常造成的先天性结构缺陷，增殖凋亡分析也因此成为研究发育期或成体病如肿瘤等病理过程中的常规检测手段。
原理
TUNEL 检测凋亡实验的基本原理是在免疫组化基础上，在 DNA 断裂处进行标记脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT），并使用抗体来特异性识别标记物，达到标识凋亡细胞的目的。
材料与仪器
器材：染缸、盖玻片或封口膜、暗湿盒、荧光显微镜等
试剂：
① In situ cell death detection kit（Roche）
② 二甲苯和乙醇（100％、95％、90％、80％、70％ 用蒸馏水稀释）
③ 冲洗缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS）
④ 蛋白酶 K 工作液 10～20 mg/ml 溶于 10 mmol/L Tris/HCl（pH7.4～7.8）
步骤
TUNEL 检测凋亡实验的基本过程可分为如下几步，可参考罗氏说明书：
A. 用二甲苯浸洗 2 次，每次 5 分钟；
B. 用梯度乙醇（100％、95％、90％、80％、70％）各浸洗 1 次，每次 3 分钟；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理。
C. 在 21～37 ℃ 条件下，用蛋白酶 K 工作液处理组织 15～30 分钟（温度、时间、浓度均需摸索），一般软性组织 10 分钟足够。
D. PBS 漂洗 2 次。
E. 制备 TUNEL 反应混合液，处理组用 50 μl TdT 和 450 μl 荧光素标记的 dUTP 液混匀；而阴性对照组仅 50 μl 荧光素标记的 dUTP 液，阳性对照组先加入 100 μl DNase 1，在 15～25 ℃ 反应 10 分钟，后面步骤同处理组。
F. 加 50 μl TUNEL 反应混合液（阴性对照组仅加 50 μl 荧光素标记的 dUTP 液）于标本上，加盖玻片或封口膜，在暗湿盒中 37 ℃ 反应 1 小时。
G. PBS 漂洗 3 次。
H. 加一滴含 DAPI 的甘油，用荧光显微镜观察凋亡细胞并拍照。
注意事项
1. 进行 PBS 清洗时，每次清洗 5 分钟。
2. PBS 清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去 PBS 溶液后再进行下一步反应。
3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4. TUNEL 反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导致酶失活。
5. 荧光素标记的 dUTP 液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。结果示例如图 8-2-8 所示。
来源：丁香实验
