RNA抽提- 成功经验法则大公开

互联网2013-11-01

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本期专文要来跟大家讨论的话题是核糖核酸(RNA)的萃取，看到这里各位心中可能已经起了疑问：RNA 萃取不是很简单吗？只要照着标准步骤操作，加一加试剂就完成了，有必要大费周章特地开篇幅来谈这件事吗？其实越简单的东西遇到困难时就越难解，各位看倌就请耐着性子，听我们娓娓道来。

Lab 的经验和客户的难题

以华联基因体实验室的长期以来承接客户RNA检体的经验来说，我们经常遇到的问题是：

（1）RNA的总量不够

（2）RNA有严重的盐类污染

（3）RNA有严重的有机溶剂污染

（4）DNA污染

（5）样品降解严重。

前四项问题都还好解决，只需要再次萃取或进行纯化即可解决，但是样品降解就较为棘手，常常因重新准备检体一来一往，耗掉不少心力和时间，最后也拿不到好的结果。

客户经常会问为什么执行芯片实验会如此要求RNA质量呢？而其他的检测方法如实时定量聚合连锁反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, Q-PCR) 却不需要？

回答这个问题前就要从实验的原理说起，简单的讲Q-PCR的检测原理是针对要检测的基因，设计一对基因特异性的引子，透过反转录反应(RT)配合PCR的放大方式和及时侦测放大的产物量，藉以回推原始的RNA含量；而RT的方式主要是采用随机引子(Random_primer)、进行互补DNA (cDNA)的翻制，因此即便RNA有些微裂解，作为模板的RNA也可以忠实的被翻制成cDNA。

但是芯片实验进行，主要是以放大和讯息RNA(mRNA)完全配对的互补RNA(cRNA) ，再进行杂合反应，此步骤必须利用poly(dT)- T7启动子序列和讯息RNA的poly(A)结合后，将T7启动子序列连带的镶入反转录的cDNA的5端，再经由T7启动子驱动试管内反转录反应，生合成反股的cRNA，再进行后续的芯片杂交的实验。可想而知，如果RNA有降解严重的现象，表示许多mRNA并不能忠实的被放大因此会产生许多伪阴性的结果。

至此读者心中可能就有一个概念了，假设Q-PCR和芯片被应用在瞎子摸象的故事情节中，用Q-PCR的人只要能摸到大象的耳朵就可以说这里有大象，透过计算耳朵的数量就可以计算大象的数量；但是用芯片实验方法的人，必须先确认所摸到的个体具备大象的完整特征，才能确确实实的说这里有一只大象。这也就说明了为何芯片实验会如此要求RNA的质量。

RNA 萃取的方法有哪些？

除了传统的纯化方法，如 LiCl 沉淀等外，因应RNA研究的庞大需求，目前市面上已有许多琳琅满目的RNA萃取套组，供给不同萃取需求目的之研究，而这些产品的设计原理不外乎是利用有机溶剂进行分层萃取如：phenol-chloroform；或利用RNA于酒精中呈现疏水性的特性，进行吸附分离如：吸附性管柱 (Silica column)。一般而言，只要有正确的RNA操作观念配合正确的步骤，大致上都可以萃取出质量不错的RNA，但是不同的萃取方法所取得的RNA组成分布会有所不同，因此建议要根据所要分析的对象RNA，选择正确的萃取方法或套组，例如:如果要研究小RNA的表现就不可选择以mRNA为萃取对象的方法。此外，内源核醣核酸分解酶(RNase)含量高的样品，建议使用含phenol-chloroform的裂解液，以增加去除酶活性的能力。以下我就以TRIzol的操作步骤为例，来跟读者分享RNA萃取步骤中应注意事项及改善萃取RNA值与量的方法。

器具如何清洁？

RNA萃取过程中，会面临的最大的敌人就是RNase，RNase是一个非常顽强的RNA分解酶，它几乎无所不在，在我们所处的环境中、身体表面甚至细胞内就有内源性的RNase存在。RNase展现活性时不需要辅酶(coenzyme)或辅因子(cofactor)，在变性溶液的环境下虽然会失去活性，但是当去除变性物质后，仍然会展现些许活性，甚至在低浓度的SDS溶液中仍具有活性，因此能做到有效杜绝去除RNase的污染则RNA的萃取就成功了一半了。因此在操作前的首要工作就是，将所有器械置于180℃的高温下干烤6小时或更长时间;或者以 3% H2O2 浸泡30 分钟以上，再以灭过菌的DEPC水冲洗干净后，用铝箔包覆灭菌后使用。在操做萃取时必须于清洁、无粉尘飞扬的环境，如果环境允许的话，最好在生物柜或化学柜中操作。

样品如何收集/保存？

先前我们提及细胞内存在有内源性RNase，且其表现量在不同种类的组织中差异极大。例如脑组织和心脏组织拥有相对低的内源性RNase，但是胸腺组织和胰脏组织则保有约100,000倍于脑组织的内源RNase。因此动物组织等最好都先用液氮冷冻起来，再进行后续的处理，不建议直接丢到-80 ℃冰箱。因为急速冷冻可冻结RNase的活性，但-80 ℃冷冻算是缓慢降温，仍会造成部分RNA的降解;如果无法快速冷冻检体，也可以采用市售的检体保存液，亦可达到不错的效果。

如何进行样品的破碎及均质化？

有关样品的破碎和均质化，这个步骤的重点应该摆在如何让有机裂解液快速浸润检体，phenol-chloroform可以溶解细胞，连带的会造成蛋白变性，因此内源性RNase的活性就会去活化;相反的如果无法让细胞快速裂解使蛋白裸露进而变性，则RNase就会降解RNA，因此如何使不同组织细胞快速裂解，就是一个值得思考调整的课题，也是左右成败的关键。

就检体类型来说，一般培养细胞多为单层细胞不会遇到这样的问题，萃取较为容易，但是立体的组织进行萃取就会遇到均质化不均的问题进而造成RNA降解。因此低温的液氮碾磨就是破碎组织最有效的办法，但是液氮碾磨较为麻烦，如果遇到样品数比较多的时候耗时费功效力不彰，但如果条件允许的话，这仍然是一个好方法。但考虑效率和速度，均质机就是一个更好的选择，但是使用均质机的过程有几个重点必须注意：

（1）速度要快，在RNase展现活性前完成细胞均质化；

（2）避免产热，以免降解 RNA；

（3）不要过度研磨，过度研磨会打断DNA，造成小片段的DNA污染。

此外，在均质裂解细胞的过程中有一个常被会忽略的重点，就是一般细胞和有机裂解液的比例常被忽略，有些操作者会认为多放一些组织就可以得到大量的RNA，但是没意识到太多的组织和太少的裂解液，造成细胞无法完全被裂解，RNase无法完全被变性，效果反而适得其反，最后RNA严重降解。因此如果反应完后均质液太过粘稠无法分层，就必须再加入裂解液。

样品的离心分层

在phenol-chloroform的萃取方式中，混合液的离心转数不可任意调整，应固定于12000 g的转数，以免因沉降系数改变造成无法有效分层。当离心完成后可以明显观察到检体分成上面水层及下面有机层，而我们要的RNA就溶解在上面水层中，体积约有500~600 μl左右。此时建议用小口径的 100 或 200 μl tip将水溶液分段吸取到干净的1.5 ml的离心管中，而在这个步骤常见的失误就是:

操作的人急于将水层取出而搅动原先的分层;或感觉萃取不易想要多回收一些RNA，于是将水层尽其可能的取出，因而造成吸取到有机溶液和大量的DNA污染，造成后续实验处理上的困扰甚至实验失败，因此强烈建议只萃取7~8成的RNA水溶液进行下一个步骤，俗话说的好，所谓有失必有得，不必为了一颗树而放弃整片森林，适时的取舍可以确保后续实验顺利进行。此外一般来说，phenol与水有一定比例的互溶，所以此时的RNA水溶液中仍有一定的phenol残留，建议一定要再使用chloroform进行一次离心分层去除残存phenol。

RNA 样品的沉淀

一般我们会使用乙醇(水溶液:乙醇=1:2.5)或异丙醇(水溶液:异丙醇=1:1)进行RNA沉淀，在效果上并无明显差异，但是如果已知RNA的含量是少的，则可以使用乙醇沉淀法，并将检体置于-80 ℃冰箱间隔一个晚上再做离心的动作，并配合离心时间的增加，如此可增加RNA沉淀的回收率。

RNA 样品的清洗去除盐类

为了去除RNA沉淀物中的盐类，我们可以采用70~75%乙醇进行洗涤，可能的话尽量让核酸沉淀悬浮起来，最好的是使用两次洗涤，再将离心管放入离心机中离心，用移液器将残留的乙醇小心吸掉，稍微抽干或吹干核酸沉淀物使残存的乙醇挥发后，再以DEPC水进行回溶。

结语

如果以上所阐诉的部分您都注意到了也改善了，但是仍然不能萃取出好质量的RNA，那或许我们就必须检视我们的实验设计是否会导致RNA降解机制的活化，例如:细胞正在经历细胞凋亡或组织坏死的生理反应;或者处理的药物会直接引起RNA降解等，如果是那可能就要作实验设计修正或下修对RNA质量的要求。

以上的一些操作RNA萃取的技巧，是华联基因体实验室多年来操作过上万个各式各样RNA检体的实战经验，所累积出来的一些心得，对一些经验丰富的读者来说或许是野人献曝了。但是希望这样的经验分享能帮助那些在RNA的备制上遭遇到困难的客户们，能顺利完成RNA检体的准备工作，实验室本着使命必达的精神，认真的对待每一个交付到我们手上的样本，会用最快的速度作出最完美的结果送到委托客户的手上。如果说以上的内容有不详尽或不清楚的地方，欢迎随时和华联实验室联络讨论或经验交流，我们定会全力以赴。